Membran

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1178 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Es wurde vorgeschlagen, dass bakterielle Membranproteine durch einen als Transertion bekannten Prozess synthetisiert und in die Membran eingefügt werden können, bei dem es um die Membranassoziation ihrer kodierenden Gene geht, gefolgt von gekoppelter Transkription, Translation und Membraneinfügung. Hier liefern wir Belege dafür, dass der Erreger Vibrio parahaemolyticus Transertion nutzt, um sein Typ-III-Sekretionssystem (T3SS2) aufzubauen, um Virulenzfaktoren in Wirtszellen zu injizieren. Wir schlagen einen zweistufigen Übergangsprozess vor, bei dem der membrangebundene Co-Komponenten-Rezeptor (VtrA/VtrC) zunächst durch Gallensäuren aktiviert wird, was zur Membranassoziation und Expression seines Zielgens vtrB führt, das sich auf der T3SS2-Pathogenitätsinsel befindet. VtrB, der Transmembran-Transkriptionsaktivator von T3SS2, induziert dann die lokalisierte Expression und Membranassemblierung der T3SS2-Strukturkomponenten und ihrer Effektoren. Wir gehen davon aus, dass der vorgeschlagene Übergangsprozess von anderen Darmbakterien für den effizienten Aufbau membrangebundener Molekülkomplexe als Reaktion auf extrazelluläre Signale genutzt werden könnte.

Große molekulare Maschinen wie das Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) sind in einer Vielzahl gramnegativer enterischer pathogener Bakterien konserviert. Aufgrund der Komplexität dieses makromolekularen Injektisoms müssen sowohl seine Expression als auch sein Zusammenbau streng reguliert werden, um spezifischen Hinweisen in der Wirtsumgebung zu entsprechen und eine korrekte Lokalisierung im entsprechenden Infektionsstadium sicherzustellen1. Genau zu diesem Zweck haben Bakterien ausgefeilte Signalmechanismen entwickelt, um veränderte Wirtsbedingungen zu erkennen und sich daran anzupassen, hauptsächlich unter Verwendung von Ein- und Zweikomponentensystemen2,3. Während Zweikomponenten-Signalsysteme eine separate Transmembrankinase zur Signalerkennung und einen separaten Regulator verwenden, der durch das Zytoplasma diffundiert, um sein regulatorisches Ziel zu erreichen, nutzen Einkomponentensysteme größtenteils ein einziges zytoplasmatisches Protein, das sowohl die Sensor- als auch die Regulierungsdomäne trägt und somit beiden dient Zwecke2,3. Obwohl die meisten Einkomponenten-Regulatoren/Transkriptionsfaktoren löslich sind, ist eine Minderheit der Einkomponenten-Regulatoren/Transkriptionsfaktoren bitopisch, gekennzeichnet durch das Vorhandensein einer ligandenbindenden periplasmatischen Sensordomäne und einer zytoplasmatischen Helix-Turn-Helix (HTH). ) DNA-bindende Domäne, verbunden über eine Single-Pass-Transmembranregion3. Es wurde schon lange beschrieben, dass die ToxR-Rezeptorfamilie, einschließlich ToxR, TfoS und TcpP von Vibrio cholerae4, CadC von E. coli5 und PsaE von Yersinia6, zu dieser Klasse von transmembranen Einkomponenten-Signaltransduktionssystemen gehört. Alle Rezeptoren dieser Familie besitzen die charakteristische CadC-Superfamilie DNA-bindender HTH-Domänen, wobei ihre periplasmatischen Sensordomänen unterschiedliche Subdomänenarchitekturen aufweisen, wobei einige für ihre Aktivität Transmembran-Koregulatoren benötigen5,7,8,9,10,11. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat gezeigt, dass die Mitglieder der ToxR-Familie, die Koregulatoren für die Ligandenbindung und Stabilität benötigen, wie die periplasmatischen Heterodimere ToxR/ToxS von Vibrio cholera7,10 und VtrA/VtrC von Vibrio parahaemolyticus9,12, als Co-Komponenten-Signaltransduktionssysteme dienen statt wie herkömmliche Einkomponentensysteme13.

Da die Zielgene, die durch solche Co-Komponenten-Signaltransduktionssysteme reguliert werden, für mindestens ein membranintegriertes Protein kodieren4,5,9,14, wurde angenommen, dass ihre Wirkungsweise zunächst die Lokalisierung dieser Gene in der Nähe der Membran bei der Induktion beinhaltet15 ,16,17. Es wird angenommen, dass anschließend der als „Transertion“ bezeichnete Prozess abläuft, der durch gleichzeitige Transkription, Translation und Membraninsertion von Biosyntheseprodukten aus ihren membranlokalisierten Zielgenen gekennzeichnet ist und zur Membranassemblierung dieser Proteine führt15,16,17,18.

Das spritzenartige Injektisom Typ III Secretion System 2 (T3SS2) des gramnegativen Magen-Darm-Erregers Vibrio parahaemolyticus ist ein Multiproteinkomplex, der aus etwa 19 Kernstrukturkomponenten besteht, die alle für die Funktionalität dieses Apparats wesentlich sind19,20. Das membrangebundene heterodimere Cokomponenten-Signaltransduktionssystem VtrA/VtrC aktiviert die Expression der für diesen Apparat kodierenden Gene nach Induktion mit Gallensäuren und vermittelt so die Produktion und Injektion spezialisierter Effektorproteine in Wirtszellen, um die zellulären Prozesse des Wirts zu manipulieren13,21 ,22,23. Wie VtrA/VtrC ist VtrB ein inneres Membranprotein mit einer zytoplasmatischen N-terminalen HTH-DNA-Bindungsdomäne, gefolgt von einer Transmembranhelix, die es an die Membran bindet. Es ist ein Hauptregulator von T3SS2, der die Promotoren von Genen bindet, die für T3SS2-Komponenten kodieren, und so die Transkriptionsaktivierung durch VtrA/VtrC12,22 erleichtert.

In dieser Arbeit berichten wir, dass die kolokalisierte Expression, Produktion und Membrananordnung des T3SS2-Apparats in V. parahaemolyticus mit dem Übertragungsmechanismus übereinstimmt, der in zwei Schritten abläuft und durch zwei membraneingebettete Transkriptionsfaktoren vermittelt wird, die zusammenarbeiten. Die Bindung von Gallensäuren an die periplasmatische Domäne des Transmembran-VtrA/VtrC-Komplexes induziert die Dimerisierung und Aktivierung seines zytoplasmatischen DNA-bindenden HTH, wodurch es über den eingeschlossenen vtrB-Promotor die T3SS2-Pathogenitätsinsel an der Membran einfangen kann (Abb. 1a). Diese Membraneinfangung leitet den ersten Übergangsschritt ein, der die Expression, den Zusammenbau und die Aktivierung des membrangebundenen VtrB-Transkriptionsfaktors ermöglicht (Abb. 1b). Als Hauptregulator von T3SS2 führt VtrB dann den zweiten Transertionsschritt aus, indem es an seine Zielpromotoren innerhalb der membranassoziierten T3SS2-Pathogenitätsinsel bindet und die Transkription induziert, was zu einer lokalisierten Produktion der T3SS2-Komponenten an der Membran führt. Diese beiden Übergangsschritte ermöglichen den effizienten Aufbau des T3SS2-Apparats mit seinen Chaperon-gebundenen Effektoren (Abb. 1c).

Abbildungen zeigen eine Dimerisierung und Aktivierung von VtrA/VtrC bei der Bindung von Gallensäure, die die T3SS2-Pathogenitätsinsel mit dem vtrB-Genomort an der Innenmembran einfängt, b erster Transertionsschritt, beginnend mit der Transkriptionsinitiierung von vtrB durch VtrA/VtrC und gleichzeitiger Translation und Membraninsertion des VtrB-Proteins in unmittelbarer Nähe des membrangebundenen vtrB-Genomlocus, c zweiter Transertionsschritt, beginnend mit der Transkriptionsinitiierung von T3SS2-Struktur- und Chaperon-assoziierten Effektorgenen durch geclusterte VtrB nach Bindung an ihre jeweiligen membrannahen Promotoren und gleichzeitige Translation und Membranmontage des T3SS2-Geräts. b, c 1 = erster Übergangsschritt, 2 = zweiter Übergangsschritt.

Um die Wirkung der Gallensäure-vermittelten VtrA/VtrC-Aktivierung auf die Membrannähe des vtrB-Genomlocus besser zu verstehen, wurde eine Locus-Tagging- und Tracking-Methode verwendet, die auf einem minimalen bakteriellen Plasmid-Partitionierungs-Par-System basiert, das mit hochauflösender Mikroskopie sichtbar gemacht wurde24 ( Abb. 2a, b). Im Hintergrund des CAB2-Stammes von V. parahaemolyticus (Ergänzungstabelle 1) haben wir eine parSMT1-Sequenz aus dem E. coli-MT1-Plasmid in die intergene Region stromabwärts des vtrB-Genomorts eingeführt. Das verwandte fluoreszenzmarkierte ParBMT1 wurde unter der Kontrolle eines Arabinose-induzierbaren Promotors exprimiert, um den genomischen vtrB-Locus zu markieren und zu verfolgen (Abb. 2a). Diese Zellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit des aktivierenden Gallensalzes Taurodesoxycholat (TDC) kultiviert. Die Lokalisierung der fluoreszierend markierten vtrB-Loci innerhalb der Zellen (Abb. 2b) wurde mithilfe des Superauflösungsmoduls mit einer Vergrößerung von × 320 (~ 100 nm in xy und ~ 400 nm in z) durch Messung ihrer Abstände von den Zellen beobachtet und quantifiziert Membran (Abb. 2c, d). Die Verteilung der normalisierten Abstände der vtrB-Loci von der Membran (p') zeigte eine Membranverzerrung dieses Locus in mit TDC gezüchteten Zellen im Vergleich zu denen in Zellen, die unter nicht induzierenden Bedingungen gezüchtet wurden (Abb. 2e). Ein neutraler Locus (0, 458 Mb auf Chromosom 2 außerhalb der T3SS2-Pathogenitätsinsel) wurde gleichzeitig mit dem T3SS2-Locus unter Verwendung eines analogen Par-Systems aus dem E. coli P1-Plasmid24 überwacht (ergänzende Abbildung 1a, b). Der neutrale Ort zeigte keine Unterschiede in seiner Verteilung innerhalb von Zellen, die entweder mit oder ohne TDC kultiviert wurden (ergänzende Abbildung 1c). Wenn dagegen eine Kopie des vtrB-Promotors in den neutralen Locus integriert wurde, zeigte diese Stelle eine Gallensäure-abhängige Membranverzerrung, die der des nativen vtrB-Genomlocus ähnelte (ergänzende Abbildung 2a, b). Beim Markieren und Quantifizieren der Nähe des vtrB-Genomorts zur Membran in einem ΔvtrA/vtrC-Mutanten 25 beobachteten wir, dass die vtrB-Loci eine Tendenz in der Zellmitte aufwiesen, unabhängig davon, ob die Zellen unter induzierenden oder nicht-induzierenden Bedingungen gezüchtet wurden (ergänzende Abbildung 2c). , D). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass das aktivierte VtrA/VtrC-Cokomponenten-Signaltransduktionssystem bei der Gallensäureinduktion spezifisch den vtrB-Locus an der inneren Membran einfängt (Abb. 1a).LL

a Abbildung, die das genomische Locus-Tagging von vtrB mithilfe des parsMT1-ParBMT1-Systems in V. parahemolyticus zeigt. b Konfokale Mikroaufnahmen, die die intrazelluläre Lokalisierung der vtrB-Genomorte (grün) im Verhältnis zur Membran (rot) in V. parahaemolyticus SS2B5-Zellen zeigen, die unter nicht-induzierenden oder induzierenden (100 µM TDC) Bedingungen mit 0,02 % Arabinose-Supplementierung für YGFP kultiviert wurden. ParBMT1-Ausdruck. Die Membranen wurden mit Nilrot gefärbt. Maßstabsbalken = 2 µm. c Fluoreszenzintensitätsprofil einer V. parahaemolyticus SS2B5-Zelle, die unter nichtinduzierenden Bedingungen für die Quantifizierung der Membrannähe des vtrB-Locus gezüchtet wurde. Die Intensitätspeaks m1 und m2 bezeichnen laterale Membranfluoreszenzintensitäten, während g der Intensität des YGFP-ParBMT1-Punktums (vtrB-Locus) entspricht. d Abbildung, die die Methodik für die Normalisierung der Membrannähe des vtrB-Locus (p') beschreibt, wobei g = vtrB-Locus (µm), m1 = Seitenwand 1 (µm), m2 = Seitenwand 2 (µm), unter Verwendung des Fluoreszenzintensitätsprofils berechnet wurden für jedes YGFP-ParBMT1-Punktum. Für nachfolgende Berechnungen ist d = Durchmesser (µm), c = Zellmitte (µm) und r = Zellradius (µm). e Repräsentative Häufigkeitsverteilungsdiagramme mit nichtlinearen Regressionsanalysen (lognormal) der normalisierten vtrB-Loci-Abstände (p') in V. parahaemolyticus SS2B5-Zellen, kultiviert in nicht-induzierendem (linkes Feld) und induzierendem (100 µM TDC, rechtes Feld). N = 200 vtrB-Loci pro Bedingung. R2 = Anpassungsgüte der Regressionskurven. b, e Es wurden drei unabhängige biologische Wiederholungen durchgeführt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um zu veranschaulichen, wo die VtrB-vermittelte Expression von T3SS2 in Zellen auftritt, wurde VtrB von seinem nativen Locus aus exprimiert, wobei seine periplasmatische Komponente mit einem monomeren superfaltenden GFP markiert war, das sich innerhalb der periplasmatischen oxidativen Nische effizient falten und fluoreszieren kann26. Die Membrannähe des vtrB-Genomlocus wurde vor diesem Hintergrund gleichzeitig mit dem zuvor beschriebenen parS-ParBMT1-Locus-Tagging-System visualisiert, außer dass der YGFP-Tag von ParBMT1 gegen CFP ausgetauscht wurde. Die Lokalisierung von VtrB mit dem vtrB-Locus an der Innenmembran wurde in Zellen sowohl mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie (Abb. 3a) als auch mit Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie (ergänzende Abb. 3a) beobachtet. Eine Korrelationsanalyse, die die Fluoreszenzsignalpixelintensitäten von VtrB und dem vtrB-Locus in mit TDC induzierten Zellen vergleicht, ergab eine starke positive Korrelation zwischen diesen beiden markierten Molekülen, wobei Pearson-Korrelationskoeffizienten (R) von > 0,9 als starker Indikator für Kolokalisierung dienten (ergänzende Abb. 3b). Die Quantifizierung der Anzahl der vtrB-Loci, VtrB und vtrB-Locus-VtrB-kolokalisierten Puncta ergab, dass zwar nicht alle vtrB-Loci mit einem entsprechenden VtrB-Signal assoziiert waren, es aber keine signifikante Anzahl von VtrB-Puncta ohne ein begleitendes vtrB-Locus-Signal gab (ergänzende Abbildung). . 3c). In Abwesenheit induzierender Bedingungen zeigte der vtrB-Locus eine Voreingenommenheit in der Zellmitte ohne jegliche beobachtbare VtrB-Expression (Abb. 3a). Zusammengenommen deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass die TDC-Induktion über Transertion zur lokalisierten Expression und Montage von VtrB an der Innenmembran führt (Abb. 1b).

a Konfokale Mikroaufnahmen, die die Expression und Kolokalisierung von VtrB (falsch gefärbtes Blau) mit dem vtrB-Genomlocus (falsch gefärbtes Grün) an der Membran in V. parahaemolyticus SC295-Zellen zeigen, die unter induzierenden (100 µM TDC) vs. nicht-induzierenden Bedingungen kultiviert wurden. b Balkendiagramm, das die relative Zytotoxizität von V. parahaemolyticus CAB2 (WT), CAB4 (T3SS2−) und T3SS2-Nadelmutanten (vpa1343S3C, vpa1343S32C, vpa1343S62C, vpa1343S85C und vpa1343S91C) in HeLa-Zellen darstellt. Diagrammbalken stellen mittlere %-Lysewerte ± SD dar und schwarze Punkte stellen einzelne Datenpunkte für n = 3 technische Replikate mit 2 biologischen Replikaten pro Experiment dar. Die statistische Signifikanz wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstests berechnet und P-Werte sind angegeben (nsP > 0,05, *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001). c Immunoblot (IB) für den T2SS2-assoziierten VopL-Effektor, sekretiert von den oben genannten Stämmen unter induzierenden Bedingungen (0,05 % Gallensalz). Der Blot wurde mit Anti-(α)-VopL-Kaninchen-Primärantikörpern (1:1000) und Anti-(α)-Kaninchen-HRP-konjugierten (1:10.000) Sekundärantikörpern gefärbt. Identisch beladenes, mit Coomassie gefärbtes Gel wurde als Beladungskontrolle (LC) verwendet. d Konfokale Mikroaufnahmen von V. parahaemolyticus VPKK6 (vpa1343S3C)-Zellen, die unter induzierenden (100 µM TDC) und nicht-induzierenden Bedingungen kultiviert wurden und die Kolokalisation von T3SS2-Nadeln (falsch gefärbtes Cyan) mit dem membrangebundenen vtrB-Locus (grün) an der Membran zeigen (Rot). Der weiße Pfeil zeigt auf T3SS2-Nadeln. a, d Maßstabsbalken = 2 µm. a–d Es wurden zwei unabhängige biologische Wiederholungen durchgeführt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Von den Kernstrukturkomponenten des T3SS2-Injektisoms ist das Nadelprotein dasjenige, das die Membranen der Bakterien und der Wirtszelle verbindet, indem es ein Filament durch den extrazellulären Raum bildet und so die Einführung des Injektionsgeräts in die Wirtsmembran ermöglicht, um den Transfer zu erleichtern von bakteriellen Effektoren in das Zytosol des Wirts27. Während die meisten Strukturkomponenten von T3SS2 charakterisiert wurden, bleibt die Identität des Nadelfilamentproteins, zusätzlich zu vier anderen, aufgrund der geringen Sequenzähnlichkeit mit anderen T3SS-Nadelproteinen unklar19,20. Mithilfe empfindlicher Sequenzähnlichkeitserkennungsmethoden (HHPRED) haben wir herausgefunden, dass das T3SS2-Protein Vpa1343 die Nadelproteine des Sekretionssystems von Yersinia (YcsF, 2P58_B, Wahrscheinlichkeit 98,24 %), Salmonella (PrgI, 2X9C_A, Wahrscheinlichkeit 98,19 %), Shigella ( MxiH, 6ZNI_C, Wahrscheinlichkeit 98,19 %) und Burkholderia (BsaL, 2G0U_A, Wahrscheinlichkeit 97,24 %). Daher wird Vpa1343 als Indikator für die VtrB-vermittelte Produktion und Montage des T3SS2-Geräts verwendet.

Wir haben einen etablierten, auf Thiolchemie basierenden Ansatz gewählt, um die Bildung von T3SS2-Nadeln28 gezielt zu markieren und zu visualisieren. V. parahaemolyticus-Stämme, die Vpa1343-Nadelproteine exprimieren, die eine Serin-zu-Cystein-Mutation enthalten (S3C, S32C, S62C, S85C und S91C), wurden auf die Funktionalität ihrer T3SS2-Geräte im Hinblick auf die relative Zytotoxizität in HeLa-Zellen (Abb. 3b) und im Effektor getestet Sekret (Abb. 3c). Zusammenfassend deuten diese Daten darauf hin, dass Vpa1343S3C unter den getesteten Mutanten in der Lage war, funktionelle T3SS2-Nadelfilamente zu produzieren und daher mit Fluorophor-konjugierten Thiol-reaktiven Farbstoffen für die konfokale Bildgebung markiert werden konnte. Die parSMT1-ParBMT1-Locus-Tagging- und VtrB-msfGFP-Konstrukte wurden im V. parahaemolyticus CAB2 Δvpa1343::vpa1343-S3Ck-Hintergrund rekonstituiert und Zellen der resultierenden Stämme wurden entweder unter induzierenden (100 µM TDC) oder nicht-induzierenden Bedingungen gezüchtet. Mittels Superauflösungs- und Weitfeldbildgebung wurde beobachtet, dass die mit Alexa Fluor™ 647 C2 Maleimid gefärbten T3SS2-Nadeln (Cyan) extrazellulär sind und sich neben der äußeren Membran in der Nähe der inneren Membranlokalisation des vtrB-Genomlokus befinden (Abb. 3d, Ergänzende Abb. 5) und das VtrB-Protein (Abb. 4a, ergänzende Abb. 6a) induzieren Bedingungen für diese Stämme. Diese Nadelfilamente wurden jedoch ohne Gallensäureinduktion nicht beobachtet (Abb. 3d, ergänzende Abb. 4 und Abb. 4a, obere Felder). Maleimid färbt oberflächenexponierte Thiolgruppen gezielt an. Die selektive Maleimid-Färbung von Nadeluntereinheiten wird daher nur auf der Oberfläche von Zellen, nicht jedoch innerhalb der Membran beobachtet. Diese Färbung führt nur zu einer geringen Überlappung der nadelassoziierten Fluoreszenzsignale mit denen der Membran und von VtrB (Abb. 4a) oder den vtrB-Loci (Abb. 3d). Diese Beobachtung wurde durch die Kolokalisierungsanalyse von Weitfeldbildern des VPKK19-Stamms bestätigt, wobei 0,3

a Konfokale Mikroaufnahmen von V. parahaemolyticus SC288-Zellen, die unter induzierenden (100 µM TDC) und nicht-induzierenden Bedingungen kultiviert wurden und die Kolokalisation von VtrB (falsch gefärbtes Blau) mit T3SS2-Nadeln (falsch gefärbtes Cyan) an der Membran (rot) zeigen. Der weiße Pfeil zeigt auf die T3SS2-Nadel. b Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von VPKK12-Zellen, die unter nicht-induzierenden oder induzierenden (100 µM TDC) Bedingungen gezüchtet wurden. Dünnschnittproben wurden mit primären Anti-GFP- (1:1500) Maus- und Anti-Vpa1343- (1:500) Kaninchen-Primärantikörpern angefärbt und mit Anti-Maus-12-nm-Gold-konjugierten Antikörpern (1:1000) und Anti-Kaninchen-5 gegengefärbt nm Gold-konjugierte (1:1000) Sekundärantikörper. Schwarze Pfeile zeigen auf VtrB-Cluster, während die weißen Pfeile auf die T3SS2-Nadel(n) zeigen. Maßstabsbalken = 200 nm. b Untere Platte. c Konfokale Mikroaufnahmen von V. parahaemolyticus VPKK19-Zellen, die Membrankolokalisierung von VtrB (falsch gefärbtes Blau) und MS2-ECFP-markierter VopV-mRNA (cyan) in 100 µM TDC-induzierten Zellen im Vergleich zur nicht induzierten Kontrolle zeigen. a, c. Maßstabsbalken = 2 µm. a–c Es wurden zwei unabhängige biologische Wiederholungen durchgeführt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Der Hauptzweck des T3SS2-Apparats besteht darin, spezielle Effektorproteine in die Wirtszelle zu injizieren, wodurch die Bakterien zelluläre Prozesse untergraben und während der Infektion eine replikative Nische einrichten können29. VopV ist ein solches Effektorprotein, das spezifisch an F-Aktin der Wirtszellen bindet und so Enterotoxizität vermittelt30. Um die lokalisierte Transkription eines T3SS2-Effektors zu ermitteln, wurde VopV-mRNA mit dem MS2-System31 sichtbar gemacht, wobei 24×MS2-Bakteriophagen-RNA-Haarnadeln an der 3'-UTR eingeführt und mit fluoreszierend markiertem MS2-Hüllprotein (MCP) markiert wurden. Es wurde beobachtet, dass VtrB- und VopV-mRNA in Zellen, die unter induzierenden Bedingungen gezüchtet wurden, an der Membran kolokalisierten (R > 0,6) (ergänzende Abbildung 7a, b), ohne dass in Abwesenheit von Gallensäuren VtrB- und VopV-mRNA-Signale beobachtet werden konnten (Abb. 4c). . Die absoluten Zählungen von VtrB, VopV-mRNA und VtrB + VopV-mRNA zeigten ähnliche Assoziationstrends wie die für VtrB und die T3SS2-Nadeln beobachteten, bei denen es mehr VtrB-Punkte als entsprechende VopV-mRNA-Signale gab, diese VopV-mRNA-Punkte jedoch ein entsprechendes VtrB-Signal aufwiesen (Ergänzende Abbildung 7c). Während diesem Experiment eine Kontroll-mRNA für die Spezifität der VopV-mRNA-Lokalisierung mit VtrB fehlte, zeigen diese Ergebnisse eine Kolokalisation im Einklang mit einem zweiten Transertionsschritt, bei dem der membranlokalisierte Hauptregulator von T3SS2, VtrB, die Transkription von T3SS2-Effektoren zur Expression initiiert und Sekretion durch den T3SS2-Apparat, der in seiner unmittelbaren Nähe montiert ist.

Vor über einem halben Jahrhundert wurde die Konzeptualisierung der Transertion als praktikablen Mechanismus für den Zusammenbau von Membranproteinen vorgeschlagen und basierte auf Erkenntnissen über Membranassoziationen des bakteriellen Nukleoids und der kotranskriptionellen Translation in Bakterien15,16,32. Weitere Beweise für die Existenz des Transertionsphänomens kamen in Form eines Übersichtsartikels, in dem das Targeting und die kotranslationale Insertion von Ribosomen-naszierenden Ketten (einem Komplex aus einem Ribosom, einer mRNA und einer teilweise synthetisierten Polypeptidkette) beschrieben wurde. über den SecYEG-Kanal in die Zytoplasmamembran33. Libby et al.18 zeigten, dass die Induktion der Expression der Membranprotein-Laktosepermease (LacY) in E. coli mit einer Verschiebung der projizierten Abstände des chromosomalen Lac-Locus zur Membran hin verbunden war. Sie stellten fest, dass diese Beobachtung auf eine Verringerung des Abstands zwischen der Membran und dem chromosomalen Lac-Locus in einer Zellpopulation bei der Induktion zurückzuführen war, da eine solche Verschiebung in Abwesenheit des Induktors nicht beobachtet wurde.

Während seitdem mehrere Studien Teilbereiche des Transertionsphänomens untersucht haben18,34,35,36,37, haben wir hier experimentelle Beweise geliefert, die die Rolle der Transertion bei der Kopplung eines Co-Komponenten-Signaltransduktionssystems mit einem membrangebundenen Transkriptionsfaktor zur Vermittlung des lokalisierten Phänomens belegen Einsatz eines großen Virulenzsystems als Reaktion auf einen externen Reiz. Die Erhaltung solcher durch Co-Komponenten-Signaltransduktionssysteme vermittelten Relaisnetzwerke in Darmbakterien wurde in einer kürzlich durchgeführten Studie mit detaillierter Identifizierung einer neuen Familie sich schnell entwickelnder Rezeptoren in Darmbakterien aufgedeckt13. Ein charakteristisches Merkmal dieser Rezeptoren ist, dass sie heterodimerer Natur sind und wie VtrA/C eine lipidbindende Lipocalin-ähnliche Faltung in ihrer periplasmatischen Domäne besitzen, um Lipide für die Regulierung von Virulenzsystemen zu erkennen13. Daher verleihen diese Ergebnisse nicht nur der Annahme Glaubwürdigkeit, dass membrangebundene Transkriptionsfaktoren für die präzise räumlich-zeitliche Regulierung bakterieller molekularer Maschinen existieren, sondern schaffen auch die Grundlage für ein neuartiges Forschungsgebiet, in dem biosynthetische Komponenten untersucht werden, die zum Zusammenbau von Molekülen für die Produktion von Membran- gebundene Komplexe in verschiedenen Darmbakterien.

Warum die Übertragung für Bakterien von Vorteil sein könnte, wurde über eine Reihe von Theorien diskutiert. Dazu gehören die Anordnung heterogener Membranproteine, die Organisation von Chromosomen und/oder der effiziente Einbau von Proteinen in die Membran38,39,40. Hier schlagen wir vor, dass die Transertion für den effizienten Aufbau einer komplexen, in eine molekulare Membran eingebetteten Maschine verwendet wird. Für Vibrio parahaemolyticus wäre dies die T3SS2-Virulenzmaschine.

Die Definition von Transertion umfasst die Konzepte der Kolokalisierung und der Parallelität. Unsere Daten veranschaulichen deutlich die Kolokalisierung eines Membranrezeptors, genetischen Materials und eines in die Membran eingeführten Produkts. Allerdings deutet nur die Schuld durch Assoziation auf das Zusammentreffen von Transkription, Übersetzung und Einfügung hin. Möglicherweise sind diese Prozesse dynamischer als das, was wir mit statischen Bildern erfassen könnten. Zukünftige Bemühungen mit Studien mit höherer Auflösung und der Verwendung von Zeitrafferbildern sollten diesen Prozess weiter definieren.

Alle in dieser Studie verwendeten Bakterienstämme sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Medien von Fisher Scientific™ und die chemischen Reagenzien von Sigma-Aldrich bezogen. E. coli- und V. cholerae-Stämme wurden bei 37 °C in Miller's Luria Bertani (LB)-Brühe unter Rühren kultiviert. Bei Bedarf wurde das Medium entweder mit 50 µg/ml Kanamycin, 25 µg/ml Chloramphenicol oder 50 µg/ml Zeocin ergänzt. V. parahaemolyticus-Stämme wurden routinemäßig in LB-Brühe, ergänzt mit 3 % (w/v) NaCl (MLB), bei 30 °C kultiviert, sofern nicht anders angegeben, und bei Bedarf entweder mit 250 µg/ml Kanamycin oder 25 µg/ml Chloramphenicol ergänzt .

Für die extrachromosomale Expression von Genfragmenten wurde das pLAU53-Vektorrückgrat verwendet. Zunächst wurde der Vektor mit den Primern Lf/pLAU53_nobla_KpnI und Ri/pLAU53_nobla_SpeI PCR-linearisiert, um die AmpR-Kassette zu entfernen. Anschließend wurde die KanR-Kassette aus dem pET28a-Vektor (F/pET28a_KmR_KpnI & R/pET28a_KmR_SpeI) PCR-amplifiziert, mit KpnI/SpeI restriktionsverdaut und in den linearisierten Vektor ligiert, der auf ähnliche Weise verdaut wurde, um pLAU(Kan) zu ergeben. SS2A5 wurde durch Amplifikation des ygfp-parBMT1-Genfragments aus chromosomaler TND1379-DNA unter Verwendung der Primer F/ygfp-parBMT1_NheI und R/parBMT1_HindIII konstruiert, wobei NheI/HindIII sowohl das Fragment als auch den pLAU(Kan)-Vektor verdaut und das resultierende Fragment hineinligiert hat das linearisierte Vektorrückgrat. Für SS1I9 wurde das synthetisierte 1,42 Mbp-parSMT1-Genfragment aus SS1I3 mit den Enzymen SacI/SalI verdaut und in das linearisierte pDM4-Rückgrat (SacI/SalI) ligiert. Um das 0,458 Mbp-parSP1-Fragment in pDM4 zu klonieren, wurden zunächst die Primer KK23/KK45 und KK28/KK46 verwendet, um ~1 Kbp-Regionen, die die chromosomale Insertionsstelle flankieren, durch PCR zu amplifizieren und die parSP1-Sequenz einzuschließen. Diese beiden Fragmente wurden dann mithilfe von Gibson Assembly in das PCR-linearisierte pDM4-Rückgrat (KK21/KK22) integriert, um SC300 herzustellen. NG56 wurde auf ähnliche Weise konstruiert, indem Pvpa1348 (KK61/KK62) aus dem CAB2-Chromosom in das PCR-linearisierte SC300 (KK59/KK60) eingefügt wurde. ECKK7 [cfp-parBP1-ygfp-parBMT1 von TND1379 (KK15/KK16) in pLAU(Kan) (KK13/KK14)], SC299 [~±1 Kbp vpa1348 von CAB2 (KK52/KK57 und KK55/KK56) und msgfp von pC014 -lwcas13a-msfgfp (KK53/KK54) in pDM4 (KK49/KK58)] und ECKK12 [mcp (KK68/KK69) aus pDZ274 und ecfp (KK70/KK71) aus pLAU(Kan) in pLAU(Kan) (KK66/KK67). )] wurden mit einer ähnlichen Gibson Assembly-basierten Strategie konstruiert. Für ECKK11 wurden ~±1 Kbp vpa1357 aus CAB2 (KK72/KK40 und KK43/KK73) und ms2SL aus pDZ415 (KK41/KK42) mit BglII/XhoI restriktionsverdaut und in das ähnlich verdaute pDM4-Rückgrat eingefügt. Um die Konstrukte für die Cys-Markierung von Vpa1343 zu erzeugen, wurde vpa1343 einschließlich 3 Kbp stromaufwärts und stromabwärts flankierender Regionen zunächst mit den Primern F/pUC18-1343_BamHI und R/pUC18-1343_EcoRI amplifiziert, mit BamHI/EcoRI verdaut und in das pUC18-Rückgrat ligiert. Um das PCR-Screening nachfolgender Nadelmutanten zu unterstützen, wurde eine KpnI-Restriktionsstelle in vpa1343 bei T153 mithilfe ortsgerichteter Mutagenese (F/sdm1343_KpnI und R/sdm1343_KpnI) eingeführt. Das Plasmid wurde mit BglII verdaut und das resultierende 1,3 Kbp vpa1343-kpnI wurde in das pDM4-Rückgrat (SS1G7) kloniert. Aufeinanderfolgende Vpa1343-Cys-Markierungskonstrukte wurden unter Verwendung ortsgerichteter Mutagenese mit ihren entsprechenden Primern hergestellt, die in der Ergänzungstabelle aufgeführt sind. 1.

Sowohl pLAU(Kan)- als auch pDM4-basierte Vektoren wurden über triparentale Konjugation, erleichtert durch E. coli DH5α (pRK2043), in ihre entsprechenden Empfängerstämme V. parahaemolyticus eingefügt. Die Transkonjuganten wurden auf Agarplatten mit minimalem Meeresmedium (MMM), die entweder 250 µg/ml Kanamycin oder 25 µg/ml Chloramphenicol enthielten, für pLAU(Kan) bzw. pDM4-abgeleitete Konstrukte ausgewählt und durch PCR bestätigt. Der Allelaustausch für In-Frame-Deletionen/-Additionen/-Substitutionen in V. parahaemolyticus-Stämmen unter Verwendung von pDM4-basierten Konstrukten wurde durch anschließendes Wachstum auf MMM-Agarplatten, ergänzt mit 15 % (w/v) Saccharose zur Gegenselektion, durchgeführt. Die resultierenden Mutanten wurden durch PCR und Sequenzierung verifiziert.

V. parahaemolyticus-Stämme wurden über Nacht in MLB bei 30 °C gezüchtet und am folgenden Tag in frischem Medium auf OD600 = 0,3 verdünnt. Die T3SS2-Expression wurde durch Ergänzung des Mediums mit 0,05 % Gallensalzen und 3-stündiges Inkubieren der Kulturen bei 37 °C22 induziert. Gleiche Volumina an Bakterienkulturen, normalisiert auf eine OD600 = 0,5, wurden 10 Minuten lang bei 4000 × g zentrifugiert. Die Pellet/Expressionsfraktion wurde in 2× Laemmli-Puffer resuspendiert. Die Überstands-/Sekretionsfraktionen wurden durch einen 0,22-µM-Filter filtriert und unter Verwendung von 150 µg/ml Desoxycholat und Behandlung über Nacht mit 7,5 % (v/v) Trichloressigsäure bei 4 °C präzipitiert. Am folgenden Tag wurden die ausgefällten Proteine durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 16.000 × g gesammelt, die Pellets wurden zweimal in Aceton gewaschen und in 2 × Laemmli-Puffer resuspendiert. Zur Bestimmung der Expressions- und Sekretionsniveaus wurde eine Western-Blot-Analyse verwendet. Unbeschnittene Western Blots und Ladekontrollgele sind in der Quelldatendatei enthalten.

HeLa-Zellen wurden mit 7 × 104 Zellen pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung in einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen ausplattiert und konnten 16–18 Stunden lang wachsen. Bakterienkulturen wurden wie zuvor beschrieben zur T3SS2-Expression induziert, indem die Zellen 90 Minuten lang bei 37 ° C gezüchtet wurden. Die induzierten V. parahaemolyticus-Kulturen wurden mit einer MOI von 10 zu den HeLa-Zellen gegeben und die Infektion wurde synchronisiert, indem die Platte sofort 5 Minuten lang bei 1000 × g heruntergeschleudert wurde. 100 µg/ml Gentamycin wurden den HeLa-Zellen 2 Stunden nach der Infektion zugesetzt. 200 µl des verbrauchten Mediums aus jeder Vertiefung wurden 7 Stunden nach der Gentamycin-Behandlung gesammelt und in einer Platte mit 96 Vertiefungen 5 Minuten lang bei 1000 × g zentrifugiert. 100 µl des resultierenden Überstands wurden unter Verwendung des Zytotoxizitäts-Nachweiskits (Takara Bio) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf Wirtszelllyse untersucht. Als Positivkontrolle wurden HeLa-Zellen aus der nicht infizierten Kontrollvertiefung am Ende der Gentamycin-Behandlung 10 Minuten lang mit 1 % Triton X-100 behandelt. Die HeLa-Zelllyse durch die V. parahaemolyticus-Stämme wurde als Prozentsatz der durch die Triton-Behandlung induzierten Zelllyse ausgedrückt.

Die T3SS2-Expression in V. parahaemolyticus-Stämmen wurde auf ähnliche Weise wie oben beschrieben eingeleitet, wobei 100 µM Taurodesoxycholat (TDC) als induzierendes Gallensalz verwendet und 25 Minuten lang bei 37 °C inkubiert wurde. Bei Bedarf wurde das Medium zusätzlich mit 0,02 % Arabinose ergänzt, um das ParB-Fusionsprotein des genomischen Locus-Tagging-Systems zu exprimieren. Den Kulturen wurden Nilrot (1 µg/ml) und Alexa Fluor™ 647 C2 Maleimid (10 µM) zugesetzt und weitere 20 Minuten bei 37 °C inkubiert, um die Membran bzw. die T3SS2-Nadeln anzufärben. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation bei 6000 × g gesammelt und 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 3,2 % Paraformaldehyd fixiert. Die Zellpellets wurden dreimal mit 1 × PBS gewaschen und entweder sofort abgebildet oder für die Bildgebung am nächsten Tag bei 4 °C gelagert. 0,5 µl der Zellen wurden auf 1 % Agarose-Pads auf Glasobjektträgern getupft und vor dem Hinzufügen des Deckglases trocknen gelassen. Superauflösende Bilder wurden als Z-Stapel mit dem Olympus Spin-SR Spinning Disk Confocal Microscope System bei 320-facher Vergrößerung (100-faches Ölobjektiv gekoppelt mit dem 3,2-fachen Superauflösungsmodul) aufgenommen. Wie bereits erwähnt, wurden Weitfeldbilder mit demselben Bildgebungssystem bei 100-facher Vergrößerung aufgenommen, um globale Muster der Fluorophor-Expression und Kolokalisierung zu ermitteln.

V. parahaemolyticus-Stämme wurden in MLB bei 37 °C 45 Minuten lang ohne oder mit 100 µM TDC kultiviert, um die T3SS2-Expression zu induzieren. Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei 4000 × g gesammelt, in 0,2 M Phosphatpuffer gewaschen und dann mit 8 % Paraformaldehyd in 0,2 M Phosphatpuffer 10 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert. Nach einem zusätzlichen Waschen mit 0,2 M Phosphatpuffer wurden die Zellpellets in 0,1 M Phosphatpuffer mit 4 % Paraformaldehyd resuspendiert. Die Proben wurden anschließend in LR White-Harz eingebettet, in dünne Scheiben geschnitten, auf nickelbeschichteten Gittern montiert und mit der entsprechenden Konzentration an Primär- und Nano-Gold-konjugierten Sekundärantikörpern für die Transmissionselektronenmikroskopie angefärbt. Die gesamte Bildgebung wurde mit dem Transmissionselektronenmikroskop JEOL 1400 Plus, ausgestattet mit einer BIOSPR-CCD-Kamera, in der EM-Kernanlage des University of Texas Southwestern Medical Center durchgeführt.

Alle Bilder wurden mit der mitgelieferten cellSens Dimension-Software verarbeitet. Zur Beseitigung des Bildrauschens wurde eine eingeschränkte iterative Dekonvolution (cellSens TruSight 3D Deconvolution-Modul) durchgeführt, die für hochauflösende Mikroskopie (20 Iterationen) optimiert ist. Die resultierenden Bilder wurden zur Berechnung linearer Fluoreszenzintensitätsprofile (cellSens Count & Measure-Modul) verwendet. Zur Rauschreduzierung von Weitfeldbildern wurde eine für die Weitfeldmikroskopie optimierte eingeschränkte iterative Entfaltung (5 Iterationen) durchgeführt.

Alle Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung aus zwei oder mehr unabhängigen Experimenten dargestellt, die jeweils in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden, sofern nicht anders angegeben. Die grafische Darstellung und statistische Datenanalyse erfolgte mit Prism 9 Version 9.5.0. Sofern nicht anders angegeben, wurden zur Durchführung statistischer Analysen eine einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstests verwendet, wobei ein ap-Wert <0,05 als signifikant angesehen wurde. Pixelintensitätskorrelationen und Berechnungen des Kolokalisierungskoeffizienten (Pearson-Korrelationskoeffizienten „R“) wurden mit Coloc 2 Version 3.0.5 durchgeführt. Streudiagramme der Pixelintensitäten wurden in ScatterJn41 Version 1.0 erstellt. Sowohl die Module Coloc 2 als auch ScatterJn wurden in ImageJ2 Version 2.9.0 (Build 133148d777) ausgeführt. An den Membrannähe-Häufigkeitsverteilungen fluoreszierender genomischer Loci wurden nichtlineare Regressionsanalysen unter Verwendung der Gaußschen Lognormalgleichung durchgeführt. Die Anpassungsgüte der Regressionskurven wurde durch R2-Werte angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Eine Berichtszusammenfassung für diesen Artikel ist als Zusatzinformationsdatei verfügbar. Die wichtigsten Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen ergänzenden Abbildungen verfügbar. Die Quelldaten, die den Abb. zugrunde liegen. 2–4, Ergänzende Abbildungen. 1–3 und ergänzende Abbildungen. 6–7 werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Spezifische Daten-P-Werte sind ebenfalls in der Quelldatendatei enthalten. Weitere Details zu Datensätzen wie Rohaufnahmen und Protokollen, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken den Orth-Labormitgliedern für ihre Diskussionen und Bearbeitung. Wir danken auch Katherine Luby-Phelps und Phoebe Doss von der UT Southwestern Electron Microscopy Core Facility für ihre Unterstützung bei der TEM-Probenvorbereitung und der Verwendung des JEOL 1400 Plus-Systems. Die Studie wurde durch den Welch Foundation Grant I-1561, die Once Upon a Time… Foundation, die National Institutes of Health Grants R35 GM 134945 (an KO), R35 GM128674 (an ABD) und den National Institutes of Health Shared Instrumentation Grant 1S10OD021685 finanziert. 01A1 bis KLPKO ist ein WW Caruth, Jr. Biomedical Scholar mit einem Earl A. Forsythe Chair in Biomedical Science.

Abteilung für Molekularbiologie, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, 75390, USA

Karan Gautam Kaval, Jananee Jaishankar und Kim Orth

Howard Hughes Medical Institute, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, 75390, USA

Karan Gautam Kaval & Kim Orth

Reata Pharmaceuticals, Plano, TX, 75204, USA

Suneeta Chimalapati

Biomanufacturing Training and Education Center, North Carolina State University, Raleigh, NC, 27606, USA

Siegel Sara D.

Abteilung für Mikrobiologie und Zellwissenschaft, University of Florida, Gainesville, FL, 32611, USA

Nalleli Garcia

Fachbereich Biologie, Indiana University, Bloomington, IN, 47405, USA

Ankur B. Dalia

Abteilung für Biochemie, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, 75390, USA

Kim Orth

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KGK, SC, SDS und KO haben die Experimente entworfen; KGK, SC, SDS und NG führten Experimente durch; KGK führte Mikroskopie durch; KGKSCSDS, JJ und NG führten Klonierung und Stammvorbereitung durch; KGK und KO haben das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Kim Orth.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kaval, KG, Chimalapati, S., Siegel, SD et al. Die membranlokalisierte Expression, Produktion und Montage von Vibrio parahaemolyticus T3SS2 liefert Hinweise auf eine Transertion. Nat Commun 14, 1178 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36762-z

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Eingegangen: 14. November 2022

Angenommen: 15. Februar 2023

Veröffentlicht: 02. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36762-z

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