Schweineplazentaextrakt erhöht den zellulären NAD-Spiegel in menschlichen epidermalen Keratinozyten

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 19040 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) ist ein essentieller Cofaktor für zahlreiche Enzyme, die am Energiestoffwechsel beteiligt sind. Da ein sinkender NAD-Spiegel ein häufiges Kennzeichen des Alterungsprozesses in verschiedenen Geweben und Organen ist, ist die Aufrechterhaltung des NAD-Spiegels in letzter Zeit für die Vorbeugung von Alterung und altersbedingten Krankheiten von Interesse. Obwohl bekannt ist, dass Plazentaextrakt (PE) mehrere Anti-Aging-Wirkungen besitzt, ist die NAD-steigernde Wirkung von PE weiterhin unbekannt. In dieser Studie fanden wir heraus, dass Schweine-PE (PPE) die intrazellulären NAD-Spiegel in normalen menschlichen epidermalen Keratinozyten (NHEKs) signifikant erhöhte. PPE schwächte auch die durch FK866, einen Inhibitor der Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase (NAMPT), induzierte NAD-Depletion ab. Interessanterweise stellte nur die Fraktion, die Nicotinamidmononukleotid (NMN), Nicotinamidribosid (NR) und Nicotinamid (NAM) enthielt, den NAD-Gehalt in NHEKs ohne NAMPT-Aktivität wieder her. Diese Ergebnisse legen nahe, dass PPE die intrazelluläre NAD erhöht, indem es NAD-Vorläufer wie NMN, NR und NAM bereitstellt. Schließlich haben wir gezeigt, dass die Anwendung von PPE auf das Stratum Corneum der rekonstruierten menschlichen Epidermis den durch FK866 induzierten NAD-Abbau deutlich verbesserte, was darauf hindeutet, dass topische PPE zur Erhöhung des NAD-Spiegels auf der Haut hilfreich sein könnte. Dies ist die erste Studie, die über die neuartige biologische Aktivität von PE als NAD-Booster in menschlichen Epidermiszellen berichtet.

Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) ist ein klassischer Cofaktor für viele Redoxreaktionen und liegt in allen lebenden Zellen in oxidierter (NAD+) und reduzierter (NADH) Form vor. NAD+ ist auch als essentielles Cosubstrat für NAD+-verbrauchende Enzyme wie Sirtuin (SIRT) und Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP) bekannt. Da diese Enzyme eine zentrale Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen spielen, darunter DNA-Reparatur, mitochondrialer Stoffwechsel und Stressresistenz, beeinflusst eine unausgeglichene NAD-Homöostase ihre zentralen Prozesse1. Der NAD-Spiegel im Gewebe/Organ nimmt mit zunehmendem Alter ab, was zu einer unausgeglichenen NAD-Homöostase führt2,3,4,5,6. Daher besteht mittlerweile Konsens darüber, dass die Aufrechterhaltung des NAD-Spiegels zur Vorbeugung und Behandlung von Alterung und altersbedingten Krankheiten beiträgt7. NAD wird über verschiedene Wege biosynthetisiert, darunter die De-novo-Biosynthese aus Tryptophan, den Preiss-Handler-Weg aus Nikotinsäure und den Salvage-Weg aus Nikotinamid (NAM)8. Bei Säugetieren ist der Salvage-Weg der wichtigste Weg zur Aufrechterhaltung der zellulären NAD-Spiegel9. Auf diesem Weg wird NAM durch NAM-Phosphoribosyltransferase (NAMPT) in Nicotinamidmononukleotid (NMN) umgewandelt und dann durch NMN-Adenylyltransferasen in NAD umgewandelt. Nicotinamid-Ribosid (NR) wird durch NR-Kinasen in NMN umgewandelt und dann in den Salvage-Weg integriert. Es wurde gezeigt, dass NAD-Zwischenmetaboliten wie NMN und NR die NAD-Spiegel in verschiedenen Zellen und Geweben erhöhen und altersbedingte Krankheiten lindern10,11.

Plazentaextrakt (PE) wird in der traditionellen Medizin häufig zur Wundheilung eingesetzt. PE ist eine reichhaltige Quelle zahlreicher bioaktiver Komponenten, darunter Aminosäuren, Nukleinsäuren, Fettsäuren, Mineralien, Vitamine, Hormone, bioaktive Peptide, Zytokine und Wachstumsfaktoren. Es ist bekannt, dass es verschiedene pharmakologische Wirkungen hat, wie z. B. entzündungshemmende, antioxidative, regenerierende und immunmodulatorische Wirkungen12. Daher wurden subkutane und intramuskuläre Injektionen von menschlichem PE (HPE) klinisch zur Behandlung mehrerer Krankheiten eingesetzt, darunter Wechseljahrsbeschwerden und chronische Lebererkrankungen13. Darüber hinaus wird HPE aufgrund seiner Auswirkungen auf das Zellwachstum und die Kollagensynthese vor allem in asiatischen Ländern klinisch als Anti-Falten-Mittel eingesetzt14. Da die Verwendung von HPE in einigen Ländern wie Japan auf medizinische Anwendungen beschränkt ist, wurde kürzlich Schweine-PE (PPE) als Alternative zu HPE entwickelt und als Rohstoff in Reformkost und Kosmetika verwendet. Eine In-vivo-Studie mit einem Maus-Kontaktdermatitis-Modell zeigte, dass topische PSA entzündungshemmende und antioxidative Wirkungen auf die Haut hat15. Klinische Studien haben gezeigt, dass topische PSA für die Behandlung chronischer, nicht heilender Wunden und die Vorbeugung von Faltenbildung von Vorteil ist16,17. Darüber hinaus wurde eine randomisierte, doppelblinde, placebokontrollierte klinische Studie an gesunden erwachsenen Frauen durchgeführt, um die Hautvorteile der oralen Einnahme von PSA zu validieren und zeigte, dass sich der Hautzustand der PSA-Einnahmegruppe deutlich verbesserte18. Diese Berichte stützen das Konzept, dass eine PSA-Behandlung die Hautalterung lindern oder verhindern kann.

PE wird üblicherweise als Anti-Aging-Mittel verwendet und zahlreiche klinische Studien haben seine Anti-Aging-Eigenschaften nachgewiesen. Der Mechanismus, der den Anti-Aging-Effekten von PE zugrunde liegt, bleibt jedoch unklar. Dieser Bericht zeigte, dass PPE mehrere NAD-Vorläufer wie NMN und NR enthält und die intrazellulären NAD-Spiegel in normalen menschlichen epidermalen Keratinozyten (NHEKs) erhöht. Unsere Ergebnisse liefern neue Einblicke in den Mechanismus, durch den PE seine Anti-Aging-Wirkung entfaltet, indem es die intrazelluläre NAD-Homöostase aufrechterhält.

Um zu untersuchen, ob PPE die zellulären NAD-Zustände verändert, haben wir NHEKs in einem mit PPE ergänzten Medium kultiviert und ihre intrazellulären NAD+- und NADH-Spiegel quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass PPE die Menge an NAD+ und NADH in NHEKs dosisabhängig signifikant erhöhte (Abb. 1A). Der Gesamt-NAD-Spiegel (NAD+ + NADH) der mit 1 mg/ml PPE behandelten Zellen war etwa 1,5-mal höher als der unbehandelter Zellen (Abb. 1A). Darüber hinaus wurde in einem Zeitverlaufsexperiment ein signifikanter Anstieg der NAD+-, NADH- und Gesamt-NAD-Spiegel nach 4-stündiger Behandlung mit 1 mg/ml PPE beobachtet (Abb. 1B). Der 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay bestätigte, dass 0,5–2 mg/ml PPE keinen Einfluss auf die Zellstoffwechselaktivität hatten, wohingegen 5 mg/ml PPE oder die Die Positivkontrolle (0,2 % Triton X-100 [TX-100]) zeigte eine signifikante Zelltoxizität (Abb. 1C). Da NAD in PPE selbst kaum nachgewiesen wurde (Daten nicht gezeigt), schien die NAD-produzierende Wirkung von PPE nicht auf den Zustrom von aus PPE stammendem NAD in NHEKs zurückzuführen zu sein. Somit legen diese Ergebnisse nahe, dass PPE die intrazellulären NAD-Spiegel erhöhen kann.

PPE erhöht den zellulären NAD-Spiegel in NHEKs. Die NHEKs wurden mit PPE in der angegebenen Konzentration oder 0,2 % TX-100 (als Positivkontrolle) für 24 Stunden (A,C) oder 1 mg/ml PPE für die angegebene Zeit (B) inkubiert. Die zellulären NAD+-, NADH- und Gesamt-NAD-Spiegel wurden mit dem NAD+/NADH-Assay-Kit bestimmt. Die Zellstoffwechselaktivität wurde mit dem MTT-Assay bestimmt. *p < 0,05 und **p < 0,01 im Vergleich zur Kontrolle.

Um festzustellen, ob PPE die zelluläre NAD-Biosynthese über die NAMPT-Reaktion im NAD-Salvage-Weg steigert, führten wir einen NAD-Wiederherstellungstest mit dem NAMPT-Inhibitor FK866 durch (Abb. 2A). FK866 reduzierte den gesamten NAD-Gehalt 24 Stunden nach der Zugabe erheblich (Abb. 2B). Interessanterweise unterdrückte PPE trotz des Fehlens von NAMPT-Aktivität in NHEKs dosisabhängig den FK866-induzierten Abbau von NAD (Abb. 2B). Viele Berichte haben gezeigt, dass PE Proteine ​​wie Zytokine und Wachstumsfaktoren enthält13,19,20. Daher gingen wir davon aus, dass einige bioaktive Proteine ​​oder Schweine-NAMPT, die in PPE enthalten sind, die intrazelluläre NAD-Biosynthese in NHEKs verbessern könnten. Um unsere Hypothese zu bestätigen, trennten wir PPE mithilfe eines Zentrifugalfiltergeräts (Grenzwert: 3 kDa) in Fraktionen mit hohem und niedrigem Molekulargewicht (HMW, LMW). Da der NAD-Wiederherstellungstest mit FK866 die Wirkung von PPE auf die NAD-Biosynthese deutlicher zeigte als ohne FK866 (Abb. 1A und 2B), haben wir mit diesem Test die aktiven Inhaltsstoffe in PPE identifiziert. Unerwarteterweise erforderte HMW-PPE eine hohe Konzentration von 1 mg/ml für eine signifikante Wiederherstellung der NAD-Spiegel, während LMW-PPE den FK866-induzierten NAD-Abbau selbst bei einer niedrigen Konzentration von 0,25 mg/ml deutlich verbesserte (Abb. 2C und D). ). Somit deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die primären Wirkstoffe in PPE kleine Moleküle mit weniger als 3 kDa sind und nicht Proteine ​​wie Wachstumsfaktoren und Zytokine.

PPE verbessert den Abbau von NAD durch FK866 in NHEKs. (A) Der Bergungsweg der NAD-Biosynthese. Die NHEKs wurden 30 Minuten lang mit FK866 vorbehandelt und 24 Stunden lang mit Voll-PPE (B), HMW-PPE (C) oder LMW-PPE (D) in den angegebenen Konzentrationen inkubiert. Die Gesamt-NAD-Spiegel wurden mit dem NAD+/NADH-Assay-Kit bestimmt. †p < 0,05 und ††p < 0,01 im Vergleich zu den angegebenen Gruppen.

Wir fraktionierten LMW-PPE mithilfe der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) weiter in 12 Fraktionen und untersuchten, welche Fraktion zur Wiederherstellung der FK866-induzierten NAD-Depletion beitrug. Ein typisches HPLC-Chromatogramm des LMW-PPE ist in Abb. 3A dargestellt. Der NAD-Wiederherstellungstest zeigte, dass nur Fraktion 3 die NAD-Spiegel in FK866-behandelten NHEKs deutlich erhöhte (Abb. 3B). NAD-Vorläufer wie NMN und NR erhöhen die intrazellulären NAD-Spiegel ohne NAMPT-Eingriff in verschiedenen Zelllinien, einschließlich NHEKs10,21. Da LMW-PPE den NAD-Gehalt in NHEKs auch dann noch erhöhte, wenn NAMPT durch FK866 gehemmt wurde, stellten wir die Hypothese auf, dass in PPE enthaltene NAD-Vorläufer die intrazelluläre NAD-Produktion steigern. Um diese Hypothese zu testen, analysierten wir Fraktion 3 mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), um die NAD-Vorläufer nachzuweisen. Die Ergebnisse zeigten, dass in Fraktion 3 drei Ionenpeaks nachgewiesen wurden, die mit NMN (m/z 335 → 123), NR (m/z 255 → 123) und NAM (m/z 123 → 80) übereinstimmen (Abb. 3C). Die Quantifizierungsanalysen ergaben, dass die Konzentration von NMN, NR und NAM im gesamten PPE 0,22, 17,62 bzw. 0,14 ng/mg betrug (Tabelle 1). Diese Ergebnisse legen nahe, dass mindestens drei NAD-Vorläufer, NMN, NR und NAM, in PPE vorhanden sind und an der intrazellulären NAD-Verstärkung beteiligt sind.

Die aktive Fraktion von LMW-PPE enthält mehrere NAD-Vorläufer. (A) LMW-PPE (1 mg) wurde abgetrennt und bei mehreren Wellenlängen (200–600 nm) mittels HPLC überwacht. (B) Die Eluenten wurden alle 2 Minuten gesammelt und in jeder Fraktion auf NAD-Rückgewinnungsaktivität getestet. (C) Die Fraktion 3 wurde mittels LC-MS/MS analysiert. Alle Verbindungen wurden im Positivionenmodus nachgewiesen.

Die Hauptwirkstoffe für die NAD-verstärkende Wirkung von PPE sind kleine Moleküle, von denen man erwarten kann, dass sie eine höhere transdermale Absorptionsfähigkeit aufweisen als größere Proteine ​​wie Wachstumsfaktoren. Daher scheint die topische Anwendung von PSA auf der Haut eine geeignete Option zur Erhöhung des NAD-Spiegels im Hautgewebe zu sein. Um zu untersuchen, ob die topische Verabreichung von PPE die NAD-Spiegel in der Epidermis unterhalb des Stratum Corneum beeinflusst, wurde eine dreidimensionale rekonstruierte menschliche Epidermis (RHE) auf der Seite des Stratum Corneum mit PPE behandelt und in einem Medium mit oder ohne FK866 kultiviert (Abb . 4A). Die topische Anwendung von PPE erhöhte die NAD-Spiegel um 9,1 % (nicht signifikant) bzw. 7,3 % (signifikant) in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von FK866 (Abb. 4B). PPE hatte keinen Einfluss auf die Zellstoffwechselaktivität, wenn es bis zu 10 mg/ml getestet wurde, wohingegen 1 % TX-100 deutlich reduziert wurde (Abb. 4C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Wirkstoffe in PSA in die subkorneale Haut eindringen und den NAD-Spiegel der Haut erhöhen können, ohne schädliche Auswirkungen zu haben.

Topische PPE zeigt bei RHE eine NAD-Wiederherstellungsaktivität, beeinflusst jedoch nicht die Zellstoffwechselaktivität. (A) Schematische Darstellung des RHE-Modells. (B) PPE (2 mg/ml) wurde auf die Stratum Corneum-Seite von RHE aufgetragen und 48 Stunden lang in Gegenwart oder Abwesenheit von FK866 (5 nM) inkubiert. Der Gesamt-NAD-Gehalt der Gewebe wurde mit dem NAD+/NADH-Assay-Kit bestimmt. (C) PPE (0, 1, 2 oder 10 mg/ml) oder 1 % TX-100 (als Positivkontrolle) wurde auf die Stratum Corneum-Seite von RHE aufgetragen und 48 Stunden lang inkubiert. Die Zellstoffwechselaktivität wurde mittels MTT-Assay bestimmt. **p < 0,01, der Vergleich zur Kontrolle.

Viele Studien haben gezeigt, dass die Abnahme der NAD aufgrund des Alterns mit dem Funktionsverlust des Gewebes und der Entwicklung altersbedingter Krankheiten und Krebs korreliert11,22. In der Epidermis führt UV-Strahlung, der wichtigste extrinsische Faktor der Hautalterung, zu einem NAD-Verlust sowie zu einer chronologischen Alterung23. Da die Haut im täglichen Leben ständig UV-Strahlung ausgesetzt ist, scheint die topische Anwendung von NAD-verstärkenden Wirkstoffen ein sinnvoller Ansatz zu sein, um die NAD-Reduktion zu verhindern und die Haut vor UV-Schäden zu schützen. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass die Erhöhung von NAD in der Haut UV-induzierten Hautkrebs und Immunsuppression bei Mäusen verhindert24. Jacobson et al. berichteten, dass topische Nikotinsäurederivate den NAD-Gehalt der Haut erhöhten und die Barrierefunktion verbesserten25. Darüber hinaus haben mehrere klinische Studien gezeigt, dass die topische Anwendung des NAD-Vorläufers NAM die Zeichen der Hautalterung reduziert26,27. Diese In-vivo- und klinischen Daten unterstützen die Möglichkeit, dass erhöhte NAD-Werte Hautschäden verhindern und die Alterung verzögern. Wir haben auch bereits früher berichtet, dass die Aufrechterhaltung eines ausreichenden NAD-Spiegels für den Schutz menschlicher Epidermiszellen vor UV-Stress von wesentlicher Bedeutung ist21. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass PPE die intrazellulären NAD-Spiegel in Keratinozyten erhöht. Wir haben außerdem herausgefunden, dass seine Wirkstoffe ein LMW von weniger als 3 kDa aufweisen, was sowohl für Monoschicht- als auch für dreidimensionale Epidermiskulturmodelle wirksam ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Wirkstoffe von PPE transdermal absorbiert werden könnten und verdeutlichen daher ihre potenzielle Anwendung als topisches Mittel zur Erhöhung des NAD-Spiegels der Haut.

In der Haut verringert ein NAD-Mangel die Funktion der wichtigsten Energiestoffwechselwege wie Glykolyse und oxidative Phosphorylierung. Die Glykolyse ist für die Aufrechterhaltung eines Gleichgewichts zwischen Keratinozytenproliferation und -differenzierung unverzichtbar28. UV-Strahlung senkt den NAD-Spiegel und kann daher dieses Ungleichgewicht beschleunigen. Es wurde beobachtet, dass das Verhältnis von Differenzierung zu Proliferation bei sonnenexponierter Haut im Vergleich zu sonnengeschützter Haut deutlich erhöht war29. Tan et al. fanden heraus, dass die Behandlung mit FK866 die Differenzierung beschleunigte und die Stoffwechselaktivität in NHEKs verringerte und dass NAM diese FK866-induzierten Ereignisse durch die Wiederherstellung der zellulären NAD-Spiegel umkehrte28. In der vorliegenden Studie haben wir herausgefunden, dass PPE den FK866-induzierten NAD-Abbau wiederherstellte. Daher kann die Bestimmung, ob PPE die Differenzierung und Proliferation in der NAD-armen Epidermis aufrechterhalten kann, zu einem besseren Verständnis ihres Anti-Aging-Mechanismus führen.

Kürzlich haben Aioi et al. zeigten, dass die topische Anwendung von PSA die Gesichtsfalten stark reduzierte und die Hautfeuchtigkeit verbesserte17. Unser vorheriger klinischer Test zeigte, dass die topische Anwendung von PPE-Creme zu einer signifikanten Verbesserung der Anti-Hautalterungsparameter wie Falten, Hautfeuchtigkeit, Erschlaffung und Tränensäcke führte (unveröffentlichte Daten). Die Ergebnisse dieser Studie können zum Verständnis des zugrunde liegenden Mechanismus beitragen, durch den PSA Falten reduziert und die Feuchtigkeitsversorgung der Haut verbessert. Ein früherer Bericht zeigte, dass die intrazellulären Gesamt-NAD-Spiegel positiv mit der Expression extrazellulärer Matrixkomponenten wie Prokollagen und Elastin in menschlichen Hautfibroblasten korrelieren30. Die Behandlung von Fibroblasten mit PPE führt zu einer erhöhten Produktion von Kollagen Typ I17. In Kombination mit diesen Fakten kann PPE die Kollagenproduktion fördern, indem es den NAD-Gehalt in Fibroblasten erhöht, was zu einer Linderung der in klinischen Studien beobachteten Hautfalten führen kann. Die Hautfeuchtigkeit ist eng mit der Barrierefunktion der Epidermisschicht verbunden. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass NAD ein wesentlicher Co-Faktor für die Aufrechterhaltung der Hautbarrierefunktion ist. Ming et al. zeigten, dass die NAD-abhängige Deacetylase SIRT1 die Expression von Filaggrin reguliert, das als Vorläuferprotein natürlicher Feuchtigkeitsfaktoren eine entscheidende Rolle für die Integrität der Hautbarriere spielt31. Darüber hinaus zeigte eine klinische Studie, dass die topische Anwendung eines NAD-Boosters den transepidermalen Wasserverlust deutlich verringerte und gleichzeitig die Dicke des Stratum Corneum bei lichtgeschädigter Haut erhöhte25. Diese Berichte deuten darauf hin, dass PPE die Barrierefunktion der Haut verbessern kann, indem sie den zellulären NAD-Spiegel in der Epidermis erhöht, was wahrscheinlich zu der in klinischen Studien festgestellten verbesserten Hautfeuchtigkeit führt.

In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass NAD-Booster die antioxidative und entzündungshemmende Wirkung verstärken. In diabetischen und septischen Mausmodellen reduzierte die NR-Verabreichung die durch fettreiche Ernährung verursachte Hirnentzündung signifikant und verhinderte jeweils den durch Lipopolysaccharid induzierten endothelialen oxidativen Stress32,33. Ähnlich wie bei NR wurde gezeigt, dass eine NMN-Supplementierung bei älteren Mäusen das proinflammatorische mRNA-Expressionsprofil in der neurovaskulären Einheit umkehrt und die Herz-Kreislauf-Funktion durch Verringerung des oxidativen Stresses verbessert34,35. Darüber hinaus ergab eine klinische Studie mit älteren Männern, dass orale NR die Konzentration zirkulierender entzündlicher Zytokine senkte36. Zusammengenommen stützen diese In-vivo- und klinischen Studien die Idee, dass die Anwendung von NAD-verstärkenden Wirkstoffen antioxidative und entzündungshemmende Wirkungen hat. Eine erhöhte SIRT-Aktivität wurde als einer der plausiblen Mechanismen vorgeschlagen, durch die diese NAD-Booster entzündungshemmende und antioxidative Wirkungen entfalten. Es ist bekannt, dass PSA eine antioxidative und entzündungshemmende Wirkung hat15; Bisher wurden jedoch relativ begrenzte mechanistische Untersuchungen durchgeführt. Die vorliegende Studie liefert zumindest eine teilweise Erklärung der Auswirkungen von PSA.

Es ist bekannt, dass PPE reichlich zellwachstumsfördernde Proteine ​​wie Laminin, Zytokine und Wachstumsfaktoren enthält. Jüngste Studien, einschließlich unserer, haben gezeigt, dass zelluläre NAD-Spiegel mit dem Zellwachstum in epidermalen Keratinozyten zusammenhängen21,28. Daher spekulierten wir, dass einige dieser Proteine ​​zum Anstieg des NAD-Gehalts beitragen könnten. Entgegen unseren Erwartungen stellten wir jedoch fest, dass ein Teil, der niedermolekulare Moleküle von weniger als 3 kDa enthielt, die NAD-Produktion in Keratinozyten förderte. Interessanterweise ergab die Fraktionierung des PPE-Anteils mittels HPLC, dass die NAD-Produktion nur in Fraktion 3 beobachtet wurde. Wir fanden auch heraus, dass Vorläufer von NAD, wie NMN, NR und NAM, in dieser Fraktion vorhanden waren, was darauf hindeutet, dass sie den Effekt erklären könnten von PSA auf die NAD-Produktion, zumindest teilweise. Da jedoch jeder in PPE enthaltene Bestandteil in sehr geringen Konzentrationen nachgewiesen wurde, scheint es schwierig zu erklären, dass diese Bestandteile allein für die Fähigkeit von PPE verantwortlich sind, den NAD-Gehalt in Keratinozyten zu fördern. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass die reduzierten Formen dieser NAD-Vorläufer, NRH und NMNH, eine größere Fähigkeit zur Produktion von NAD haben als NR und NMN37,38,39,40. Obwohl weitere Analysen erforderlich sind, um festzustellen, ob PPE NRH und NMNH enthält, kann die in dieser Studie beobachtete NAD-verstärkende Fähigkeit von PPE auf mehrere NAD-Verstärker zurückgeführt werden, darunter NMN, NR, NMNH, NRH und andere unbekannte NAD-Vorläufer.

Zusammenfassend eröffnen unsere Ergebnisse die Möglichkeit, PPE zur Verbesserung verschiedener Krankheiten und Symptome einzusetzen, indem die intrazellulären NAD-Spiegel erhöht werden, ein wesentlicher Co-Faktor, der an verschiedenen zellulären biochemischen Reaktionen beteiligt ist.

PE wurde aus gefrorener Schweineplazenta isoliert. Nachdem alle Blut- und Nabelschnurspuren entfernt worden waren, wurde die Schweineplazenta gewaschen, homogenisiert und drei Einfrier-Auftau-Zyklen unterzogen. Das Gewebehomogenat wurde 1 Minute lang bei 120 × g zentrifugiert und der Überstand gesammelt und als PPE verwendet. Um den Trockenfeststoffgehalt zu berechnen, wurde das PPE konzentriert und 5 Stunden lang bei 105 °C getrocknet. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur in einem Exsikkator wurde das Gewicht mit einer Präzisionswaage gemessen. Der Trockenfeststoffgehalt von PPE betrug 10,98 mg/ml.

NHEKs (Neugeborene/männlich, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) wurden in EpiLife™-Medium mit 60 μM Kalzium, ergänzt mit menschlichem Keratinozyten-Wachstumszusatz (beide von Thermo Fisher Scientific), bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2. Das Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt, bis die Kultur eine Konfluenz von etwa 50 % erreichte, und danach jeden Tag gewechselt. Die Zellen wurden passagiert, als sie eine Konfluenz von 80–90 % erreichten. NHEKs wurden nicht über Passage 5 hinaus verwendet.

Die Menge an NAD wurde mit dem NAD+/NADH Assay Kit-WST (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Kurz gesagt wurden 1,0 × 105 NHEKs in Platten mit 12 Vertiefungen ausgesät. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit PPE in verschiedenen Konzentrationen (0, 0,25, 0,5 und 1 mg/ml) behandelt und 1–24 Stunden lang in Gegenwart oder Abwesenheit von 5 nM FK866 (AdooQ Bioscience, Irvine, CA, USA) kultiviert ). Die Zellen wurden mit dem mitgelieferten NAD+/NADH-Extraktionspuffer lysiert und unter Verwendung eines Ultracel-10 K-Zentrifugalfiltergeräts (Merck, Darmstadt, Deutschland) ultrafiltriert. Um die NADH-Konzentration zu berechnen, wurde die Hälfte der Filtrate 60 Minuten lang bei 60 °C inkubiert, um NAD+ zu zersetzen. Alle Filtrate wurden 1 Stunde lang der enzymatischen Reaktion bei 37 °C unterzogen. Anschließend wurde die Absorption der Proben bei 450 nm mit einem Infinite 200 Pro-Plattenlesegerät (Tecan, Männedorf, Schweiz) gemessen. Der NAD+-Gehalt wurde berechnet, indem der NADH-Gehalt vom gesamten NAD-Gehalt abgezogen wurde. Die NAD+/NADH-Spiegel wurden auf die jeweiligen Proteinkonzentrationen normalisiert, die mit dem Pierce BCA-Proteinassay (Thermo Fisher Scientific) bestimmt wurden.

Die NHEKs wurden in einer Platte mit 24 Vertiefungen mit 0,5 × 105 Zellen pro Vertiefung ausgesät und 24 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 24 Stunden lang mit PPE (0,5, 1, 2 und 5 mg/ml) oder 0,2 % TX-100 behandelt. Die Zellen wurden mit 300 μl einer 1 mg/ml MTT-Lösung (Thermo Fisher Scientific) bei 37 °C und 5 % CO2 3 Stunden lang inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde in NHEKs infiltriertes Formazan mit 200 μl Dimethylsulfoxid bei Raumtemperatur 2 Stunden lang extrahiert. Die optische Absorption bei 560 nm wurde mit einem Infinite 200 Pro-Plattenlesegerät (Tecan) bestimmt.

PPE (500 μl) wurde auf ein Ultracel-3K-Zentrifugalfiltergerät (Merck Millipore) aufgetragen und 60 Minuten lang bei 16.100 × g und 4 °C zentrifugiert. Die Filtrate wurden als LMW-Fraktion von PPE verwendet. Um die Rückstände auf dem Filter zurückzugewinnen, wurden die Filtervorrichtungen kopfüber in ein neues Zentrifugenröhrchen gestellt und 5 Minuten lang bei 1000 × g und 4 °C zentrifugiert. Die Rückstände wurden mit 500 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) rekonstituiert und als HMW-Fraktion von PPE verwendet.

Zur Fraktionierung von LMW-PPE verwendeten wir ein HPLC-Gradientensystem, das mit einem Probeninjektor zum Beladen mit einer Spritze, zwei Pumpen, einem Multi-UV-Detektor MD-2010 (Jasco, Tokio, Japan) und einer C 18-Umkehrphasensäule (Inertsil) ausgestattet war ODS-3, 5 μm, 4,6 × 250 mm, GL Science, Tokio, Japan). Um eine hohe Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, wurde zur Fraktionierung eine analytische statt einer präparativen Säule verwendet. Die HPLC-Lösungsmittel waren 0,05 % Trifluoressigsäure in Wasser (A) und Acetonitril in HPLC-Qualität (B). Einhundert Mikroliter des LMW-PPE wurden auf die HPLC-Säule aufgetragen und unter Verwendung des folgenden Gradienten mit einer Flussrate von 1 ml/min getrennt: 0 bis 10 Minuten bei 100 % Lösungsmittel A halten, dann linearer Gradient von 0 % B in 10 Min. bis 95 % B in 30 Min. Die Eluenten wurden alle 2 Minuten in Probenröhrchen gesammelt und mit einem Zentrifugalverdampfer CVE-3100 (EYELA, Tokio, Japan) getrocknet. Die Rückstände wurden mit 100 μl PBS rekonstituiert und durch eine 0,22 μm-Membran filtriert, bevor der NAD-Wiederherstellungstest verwendet wurde.

NMN, NR und NAM wurden durch Isotopenverdünnung LC-MS/MS nachgewiesen und quantifiziert. Die Analysen wurden mit einem ACQUITY UPLC H-Class-System in Verbindung mit einem TQS-Micro-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (Waters, Milford, MA, USA) mit Elektrospray-Ionisation im positiven Ionenmodus durchgeführt. Zur Trennung jeder Probe wurde eine Capcell Pak ADME HR-Säule (2 μm, 2,1 × 100 mm, Osaka Soda, Osaka, Japan) verwendet. Die mobilen Phasen A–B waren Wasser-Methanol (enthaltend 0,1 % Ameisensäure und 10 mM Ammoniumformiat). Die Gradientenbedingung war wie folgt: 0–0,5 Min. (99 % A), 0,5–3 Min. (99–60 % A), 3–5 Min. (60–2 % A) und 5–7 Min. (2 % A). ). Die Flussrate betrug 0,2 ml/min. Die Kapillarspannung betrug 0,75 kV, die Quellentemperatur betrug 150 °C und die Desolvatisierungstemperatur betrug 500 °C. Der Kegelgasfluss betrug 50 l/h und der Desolvatisierungsgasfluss betrug 1100 l/h. Um jeden NAD-Vorläufer zu quantifizieren, wurde den Proben NAM-13C6 in einer Konzentration von 78 nM als interner Standard zugesetzt. Die Ionen wurden mittels Multiple Reaction Monitoring (MRM) mit den folgenden Übergängen überwacht: m/z 335 → 123 für NMN, m/z 255 → 123 für NR, m/z 123 → 80 für NAM und m/z 129 → 85 für NAM-13C6. NMN wurde von Oriental Yeast (Tokio, Japan) gekauft. NR und NAM-13C6 wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. NAM wurde von Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan) gekauft.

Das In-vitro-RHE-Modell EpiDerm™ (EPI-200) wurde von MatTek (Ashland, MA, USA) gekauft und in EPI-100-ASY-Medium (MatTek) bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Einhundert Mikroliter PPE (1, 2 und 10 mg/ml) oder 1 % TX-100 wurden auf die Stratum Corneum-Seite des RHE aufgetragen. Das RHE wurde 48 Stunden lang in EPI-100-ASY-Medium in Gegenwart oder Abwesenheit von FK866 (5 nM) inkubiert. Nach der Inkubation wurde das RHE dreimal mit PBS gewaschen. Für den NAD-Wiederfindungstest wurden die gesamten NAD-Gehalte in RHE mit dem NAD+/NADH Assay Kit-WST quantifiziert. Für den Zellstoffwechselaktivitätstest wurde das RHE auf eine Platte mit 24 Vertiefungen übertragen und mit 300 μl einer 1 mg/ml MTT-Lösung (Thermo Fisher Scientific) bei 37 °C und 5 % CO2 3 Stunden lang inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde in RHE infiltriertes Formazan mit 2 ml Dimethylsulfoxid bei Raumtemperatur 2 Stunden lang extrahiert. Die optische Absorption bei 560 nm wurde mit einem Infinite 200 Pro-Plattenlesegerät (Tecan) bestimmt. Die Absorption mit 1 % TX-100 behandeltem RHE wurde als Positivkontrolle für den Zellstoffwechselaktivitätstest verwendet.

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts von mindestens drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Alle statistischen Analysen wurden mit der EZR-Software Version 1.55 (Saitama Medical Center, Jichi Medical University, Saitama, Japan) durchgeführt. Vor dem Datenvergleich wurde die Normalverteilung durch den Shapiro-Wilk-Test bestätigt. Die Homogenität der Varianzen wurde mit dem F-Test (zwei Gruppen) und dem Bartlett-Test (mehrere Gruppen) bewertet. Die Unterschiede zwischen mehreren Gruppen wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Tukey-Post-hoc-Test ermittelt. Der Student-T-Test wurde verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen den beiden Gruppen zu testen. Die statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05 und p < 0,01 festgelegt. Sternchen und Dolche geben die statistische Signifikanz im Vergleich zur Kontrollgruppe (*p < 0,05, **p < 0,01) bzw. der angegebenen Gruppe (†p < 0,05 und ††p < 0,01) an.

Unzutreffend. Die Schweineplazenten, die innerhalb von 3 Stunden nach der spontanen Entbindung der Föten entnommen und sofort eingefroren wurden, wurden mit Zustimmung des Besitzers von einer Farm in Hokkaido, Japan, gekauft. An dieser Studie war kein lebendes Tier beteiligt.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

Nicotinamidadenindinukleotid

Reduzierter NAD

Nicotinamid

Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase

Normale menschliche epidermale Keratinozyten

Nicotinamid-Mononukleotid

Reduzierte NMN

Nicotinamid-Ribosid

Reduzierte NR

Poly-ADP-Ribose-Polymerase

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

Plazentaextrakt

PE-Schweine

Menschliche PE

Fraktion von PPE mit hohem Molekulargewicht

Anteil von PPE mit niedrigem Molekulargewicht

Rekonstruierte menschliche Epidermis

Sirtuin

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Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium der DHC Corporation unterstützt.

DHC Corporation Laboratories, Division 2, 2-42 Hamada, Mihama-ku, Chiba, 261-0025, Japan

Takeshi Katayoshi, Nobuaki Yamaura, Takahisa Nakajo, Natsuko Kitajima und Kentaro Tsuji-Naito

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Konzeptualisierung: KTN Validierung: TK, KTN Untersuchung: TK, NY, NK, TN Methodik: TK, NY, KTN Schreiben – Originalentwurf: TK Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung: NY, NK, TN, KTN Visualisierung: TK, NY Aufsicht: KTN Projektverwaltung: KTN

Korrespondenz mit Takeshi Katayoshi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Katayoshi, T., Yamaura, N., Nakajo, T. et al. Schweineplazentaextrakt erhöht den zellulären NAD-Spiegel in menschlichen epidermalen Keratinozyten. Sci Rep 12, 19040 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-23446-9

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Eingegangen: 02. Juni 2022

Angenommen: 31. Oktober 2022

Veröffentlicht: 09. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23446-9

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