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May 26, 2023

Ermittlung von T

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 269 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Infektionen mit Plasmodium ovale sind weit verbreitet, werden aber kaum untersucht und die daraus resultierende Krankheitslast wurde unterschätzt. Plasmodium ovale curtisi Duffy-Bindungsprotein-Domänenregion II (PocDBP-RII) ist ein wesentlicher Ligand für die Retikulozytenerkennung und die Wirtszellinvasion durch P. ovale curtisi. Die genomische Variation, Antigenität und Immunogenität von PocDBP-RII bleiben jedoch große Wissenslücken.

Insgesamt wurden 93 P. ovale curtisi-Proben von Wanderarbeitern gesammelt, die zwischen 2012 und 2016 aus 17 Ländern Afrikas nach China zurückkehrten. Der genetische Polymorphismus, die natürliche Selektion und die Kopienzahlvariation (CNV) wurden durch Sequenzierung und Echtzeit-PCR untersucht . Die Antigenität und Immunogenität des rekombinanten PocDBP-RII (rPocDBP-RII)-Proteins wurden weiter untersucht und die humoralen und zellulären Reaktionen immunisierter Mäuse wurden mithilfe von Protein-Microarrays und Durchflusszytometrie bewertet.

Effizient exprimiertes und gereinigtes rPocDBP-RII (39 kDa) wurde erfolgreich als Antigen zur Immunisierung bei Mäusen eingesetzt. Die Haplotyp-Diversität (Hd) des PocDBP-RII-Gens betrug 0,105 und der Nukleotid-Diversitätsindex (π) betrug 0,00011. Unter den gesammelten Isolaten von P. ovale curtisi wurde keine erhöhte Kopienzahl gefunden. Darüber hinaus induzierte rPocDBP-RII eine anhaltende antigenspezifische Antikörperproduktion mit einem Serum-IgG-Antikörpertiter von 1:16.000. Als Reaktion auf die Stimulation von rPocDBP-RII wurden IFN-γ-produzierende T-Zellen anstelle von IL-10-produzierenden Zellen aktiviert. Im Vergleich zu PBS-immunisierten Mäusen (Negativkontrolle) gab es in rPocDBP-RII-immunisierten Mäusen einen höheren Prozentsatz an CD4+CD44highCD62L− T-Zellen (Effektor-Gedächtnis-T-Zellen) und CD8+CD44highCD62L+ T-Zellen (zentrale Gedächtnis-T-Zellen).

PocDBP-RII-Sequenzen waren in klinischen Isolaten von P. ovale curtisi hoch konserviert. Das rPocDBP-RII-Protein könnte zusätzlich zur Induktion spezifischer Antikörper eine schützende Immunität im Blutstadium durch IFN-γ-produzierende CD4+- und CD8+-T-Zellen und Gedächtnis-T-Zellen vermitteln. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass das rPocDBP-RII-Protein das Potenzial hat, ein Impfstoffkandidat zu sein, der eine Bewertung und Anleitung für Maßnahmen zur Malariakontrolle und -eliminierung bietet.

Malaria ist eine Krankheit, die durch Plasmodium-Arten verursacht wird, und im Jahr 2021 gab es weltweit schätzungsweise 247 Millionen Malariafälle, wobei der größte Anstieg der Fälle in den letzten 5 Jahren in der afrikanischen Region der WHO zu verzeichnen war [1]. Unter den fünf Arten von Malariaparasiten, die Menschen infizieren, wird Plasmodium ovale aufgrund der harmlosen Malariasymptome, die es verursacht, oft übersehen. Plasmodium ovale lässt sich nachweislich in zwei genetisch unterschiedliche Unterarten namens P. ovale curtisi und P. ovale wallikeri unterteilen [2], wobei erstere einen höheren Anteil importierter Fälle, eine längere Inkubationszeit und höhere Thrombozyten- und Gesamtleukozytenzahlen verursacht als Malaria, die durch letztere verursacht wird [3, 4]. Die morphologischen Merkmale, das klinische Syndrom, das Ansprechen auf die Therapie und die rezidivierenden Merkmale von P. ovale ähneln jedoch denen von Plasmodium vivax [5], was dazu führt, dass man in der Routinediagnose leicht mit P. vivax verwechselt wird und daher die weltweite Prävalenz unterschätzt P. ovale [3, 6]. Beispielsweise zeigte eine deskriptive Studie, dass aus Afrika importierte P. ovale einen großen Anteil aller Malariafälle in der chinesischen Provinz Henan ausmachten, sogar mehr als der von P. vivax [7]. Programme zur Malaria-Eliminierung in Afrika müssen daher Strategien zur Bekämpfung dieser bisher vernachlässigten Malaria-Parasiten umfassen.

Das Duffy-bindende Protein (DBP) gilt als vielversprechender Impfstoffkandidat im Blutstadium [8], das durch Interaktion mit den Wirts-Chemokin-Duffy-Antigen-Rezeptoren (DARCs) an der Invasion der Retikulozyten des Wirts durch Merozoiten von Plasmodium vivax und P. knowlesi beteiligt ist [ 9, 10]. Die funktionellen Rezeptorbindungsdomänen von PvDBP wurden auf die N-terminale cysteinreiche Region II (DBP-RII) zurückgeführt, die auch als Duffy-binding-like (DBL)-Domäne bekannt ist [11]. Dennoch kann die allelische Diversität unter immunselektivem Druck zum Verlust der Reaktivität und funktionellen Immunogenität von PvDBP-RII führen, was eine potenzielle Herausforderung für die Impfstoffentwicklung darstellt [12, 13]. Eine weitere wichtige Art der genomischen Variation bei Plasmodium ist die Kopienanzahlvariation (CNV) [14]. Tatsächlich wurden in PvDBP-RII Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) [15] und CNVs [16] identifiziert, die die Umgehung der humoralen PvDBP-Immunität durch P. vivax fördern und die Wirksamkeit des Impfstoffs einschränken könnten. Insbesondere funktionelle Antikörper gegen DBP zeigen Zielprioritätsepitope [17], aber allelische Varianten von DBPII können die Reaktivität anderer stammspezifischer Antikörper als MBC-abgeleiteter Antikörper verändern [18]. Darüber hinaus deuten Daten aus Mausmodellen einer Malariainfektion darauf hin, dass CD4+- und CD8+-T-Zellen die Produktion von Zytokinen wie IFN-γ und IL-10 kontrollieren können [19] und dass Gedächtnis-T-Zellen dann eine schützende Immunität im Blutstadium vermitteln [20, 21]. ].

In einer früheren Studie wurde berichtet, dass die Duffy-Bindungsproteindomänenregion II (PocDBP-RII) von P. ovale curtisi als wichtiger Ligand im Invasionsprozess von Retikulozyten durch P. ovale curtisi fungieren könnte [22]. Bisherige Studien haben sich jedoch nicht der Aufdeckung der genetischen Vielfalt und der Genamplifikation von PocDBP-RII gewidmet. In dieser Studie haben wir im Zeitraum 2012–2016 93 P. ovale curtisi-Isolate aus Malaria-Endemiegebieten in Afrika ausgewählt, um den genetischen Polymorphismus, die natürliche Selektion und die CNVs von PocDBP-RII zu untersuchen. Um außerdem neue Informationen über die Eignung von rPocDBP-RII als neuartigen Impfstoffkandidaten für P. ovale curtisi zu untersuchen, wurden die Antigenität und Immunogenität von rPocDBP-RII mithilfe von Protein-Microarrays und durchflusszytometrischer Analyse gemessen.

Von 2012 bis 2016 wurden in einem Referenzlabor für Malariadiagnostik in der chinesischen Provinz Jiangsu insgesamt 93 Blutproben von importierten Malariapatienten mit P. ovale entnommen, die durch mikroskopische und epidemiologische Untersuchungen identifiziert wurden. Die genomische Plasmodium-DNA (gDNA) aus 200 μl Blut Die Proben wurden mit dem QIAamp™ DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Inc., Valencia, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die Unterart von P. ovale curtisi wurde weiter durch einen Nested-PCR-Assay und eine Echtzeit-TaqMan-PCR bestimmt, wie in einer früheren Veröffentlichung berichtet [23]. Die PCR-Produkte wurden von Tanlen-bio Scientific (Wuxi, China) sequenziert. Die für die Sequenzierung verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die erfassten DNA-Sequenzen wurden mit Referenzgensequenzen aus PocDBP (PlasmoDB, PocGH01_00129200) in der Plasmodium Genome Resource-Datenbank abgeglichen.

Die PocDBP-Sequenz (PlasmoDB, PocGH01_00129200) wurde als Vorlage zur Bewertung der Nukleotiddiversität verwendet. Die Mehrfachsequenz-Alignments von 93 Isolaten, die die wilde Referenzsequenz von PocDBP-RII enthielten, wurden mit MUSCLE im Programm MEGA v7.0.18 erhalten [24]. Die Anzahl der Einzelnukleotid-Polymorphismusstellen (SNPs), Haplotypen (H), Haplotyp-Diversität (Hd) und Nukleotid-Diversität (π) wurden berechnet, um die genetische Diversität mithilfe des Programms DNASP v5.10.01 zu bewerten. Speziesinterne Tests zum Nachweis der Neutralität (Tajimas D-Test, Fu und Lis D*- und Fu und Lis F*-Tests) wurden durchgeführt, um das Vorhandensein einer Richtungs- oder Ausgleichsselektion festzustellen [25, 26]. Signifikante positive Werte von Tajimas D oder Fu und Lis D* und Fu und Lis F* stellen einen Populationsrückgang aufgrund der Selektion dar, während negative Werte eine Populationsausweitung und einen Überschuss an Singletons darstellen. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Die PocDBP-RII-Genkopienzahl (CN) wurde durch einen quantitativen Echtzeit-SYBR-Green-PCR-Assay (qPCR) geschätzt [23, 27]. Primersequenzen, die für die Konstruktion von Referenzplasmiden mit einer oder zwei Kopien von PocDBP-RII verwendet wurden, sind in Tabelle 1 dargestellt. Aufgrund des Fehlens der Existenz von P. ovale curtisi-Isolaten mit bekannten Kopien der untersuchten Gene als Kalibrator wurden die Referenzplasmide verwendet mit einer Kopie von PocDBP-RII (pREF1) und zwei Kopien von PocDBP-RII (pREF2) wurden durch Einfügen von PocDBP-RII- (nt, 48–545) und PocFBPA- (nt, 1–619) Fragmenten in einem Verhältnis von konstruiert 1:1 oder 2:1 in den pMD18-T-Vektor (Katalog-Nr. 6011, TAKARA) unter Verwendung des TA Cloning and Seamless Cloning Kit (Katalog-Nr. D7010S, Beyotime, Shanghai, China). Kurz gesagt, PCR-Reaktionen wurden auf einem Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) durchgeführt. Jede Reaktion bestand aus 1 × ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Katalog-Nr. Q311-02, Vazyme, Jiangsu, China), 150 nM jedes Vorwärts- und Rückwärtsprimers, 1 × ROX-Referenzfarbstoff 2, 1,2 μl gDNA oder 2 μl verdünnt Plasmid-DNA und Wasser bis zu 20 μl. Die Reaktionsbedingungen waren 95 °C für 30 s, dann 40 Zyklen von 95 °C für 10 s und 60 °C für 34 s. Am Ende des Amplifikationszyklus wurde eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt, um zu bestätigen, dass die synthetisierten Produkte korrekt waren. Um die Wirkung von aus Vollblut extrahierter menschlicher gDNA auszuschließen, wurde gDNA von gesunden Personen als Negativkontrolle verwendet. Bei jedem Experiment wurde jede einzelne Probe in zwei Vertiefungen getestet und alle Proben wurden wiederholt, wenn die Standardabweichung (SD) der Werte des Zwei-Schwellen-Zyklus (Ct) > 0,5 war oder der ΔCt-Wert zwischen Testprobe und Negativkontrolle < 3 war. Textberichte mit den Ct-Werten für jede Vertiefung wurden nach Excel (Microsoft) exportiert und mit der 2−∆∆Ct-Methode der relativen Quantifizierung analysiert, um die Kopienzahlen abzuschätzen. Wenn die N-fache Kopienzahl zwischen diesen Werten lag (0,7 < N-fach < 1,3), wurde davon ausgegangen, dass die Testprobe eine Kopie des Zielgens trug. Die Testprobe mit zwei CNs wurde mit einem N-fach > 1,3 wiederholt, um die Zuverlässigkeit der Amplifikationsergebnisse sicherzustellen.

Das rPocDBP-RII-Protein wurde wie in einer früheren Studie beschrieben exprimiert [22]. Kurz gesagt, die PCR-Amplifikation von PocDBP-RII wurde mit Phusion High-Fidelity-DNA-Polymerase (Katalog-Nr. F530S, Thermo Scientific, Schweden) unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern (Tabelle 1) durchgeführt und mit dem Seamless Cloning Kit in den pET28a-Vektor kloniert. Anschließend wurde der Escherichia coli-Stamm Rosetta (DE3) (Katalognr. CB108, TIANGEN, Peking, China) mit dem rekombinanten Plasmid transformiert, auf einer LB-Agarplatte (mit 20 µg/ml Kanamycin) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Eine einzelne Kolonie wurde gepickt und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln bei 200 U/min in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 20 ml LB-Medium (ergänzt mit 20 µg/ml Kanamycin) inokuliert. Die Starterkultur wurde in einen Kolben mit 1000 ml LB-Medium mit Kanamycin bei 37 °C inokuliert, bis die optische Dichte 0,6 bei 600 nm (OD600) erreichte. Die Expression wurde mit 0,5 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) (Katalog-Nr. I8070, Solarbio, Peking, China) bei 30 °C induziert. Sechs Stunden später wurden die Zellen durch 10-minütige Zentrifugation bei 5000 × g und 4 ° C geerntet. Das Pellet wurde sofort über Nacht bei –20 °C gelagert.

Die Zellen wurden aufgetaut und in Lysepuffer resuspendiert: 100 mM Na2HPO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M Harnstoff, pH 8,0. Die Isolierung der Einschlusskörper erfolgte durch Ultraschall und Zentrifugation bei niedriger Temperatur. Die gewaschenen Einschlusskörper wurden mit Lysepuffer, der 8 M Harnstoff enthielt, unter reziproker Rotation über Nacht bei 4 °C solubilisiert. Das rPocDBP-RII-Protein wurde unter Verwendung eines hochaffinen nickelbeladenen Nitrilotriessigsäureharzes (Ni-NTA) (Katalognummer L00250, GenScript, Jiangsu, China) gereinigt. Für die schrittweise Dialyse wurden 6 M, 4 M und 2 M Harnstoff getrennt verwendet, um Harnstoff langsam zu entfernen und die Rückfaltung zu fördern. Jedes Mal wurde die Probe > 12 Stunden lang bei 4 °C unter Rühren inkubiert. Um den Konzentrationseffekt nach der letzten Dialyse zu erzielen, wurde die Ultrafiltrationsmethode eingesetzt. Das gereinigte und konzentrierte rPocDBP-RII-Protein wurde mit 2 × Ladefarbstoffen mit und ohne Dithiothreitol (DTT, reduzierende Bedingung) behandelt und dann durch 12 % SDS-PAGE mit Coomassie Brilliant Blue R-250 PAGE-Färbung, Western Blot und Pierce BCA-Protein analysiert Assay-Kit. Darüber hinaus zeigte der Endotoxintest, dass die Endotoxinmenge in rPocDBP-RII < 1 EU/ml betrug.

BALB/c-Mäuse (weiblich, 6 Wochen alt) wurden vom Experimental Animal Center der Yangzhou University (Yangzhou, China) bezogen. Jeder Maus wurde als primäre Immunisierung die Emulsion subkutan injiziert, die 50 μg rPocDBP-RII (n = 5) oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; n = 3), gemischt mit Freunds vollständigem Adjuvans (Katalog-Nr. F5881, Sigma), enthielt [ 28, 29]. Nachfolgende Auffrischungen wurden mit der gleichen Menge an Antigen oder PBS pro Tier, emulgiert in unvollständigem Freund-Adjuvans (Katalog-Nr. F5506, Sigma-Aldrich), an den Tagen 14 und 28 nach der ersten Injektion durchgeführt. Vom Blut getrennte Mäuseserumproben wurden gesammelt und an den Tagen 0, 14, 28, 42 und 70 zur späteren Verwendung bei –80 ° C gelagert.

Die Serumreaktion gegen gereinigte rekombinante Proteine ​​wurde unter Verwendung von Amin-Arrays vom Well-Typ wie zuvor beschrieben bestimmt [30, 31]. Für die Tests wurden Teflonbänder mit Löchern als Protein-Mikroarrays auf Adhäsionsmikroskop-Objektträger (CITOTEST Scientific, Jiangsu, China) geklebt; 1 μl rPocDBP-RII (50 μg/μl) wurde auf jede Vertiefung der Arrays aufgetragen und 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Array-Objektträger wurden 1 Stunde lang mit 5 % BSA in PBST bei 37 °C blockiert. Auf 1:250 verdünnte Serumproben aus jeder der vier Blutentnahmeperioden oder ein Satz 1:2-Serienverdünnungen von 1:250 bis 1:32.000 aus der dritten und vierten Blutentnahmeperiode wurden 1 Stunde lang auf den Chip gegeben 37 °C. Als Negativkontrollen dienten Präimmunserum und Serum von Mäusen, die nur mit Adjuvans immunisiert wurden. Schließlich wurden gebundene Antikörper mit Alexa Fluor 555-markiertem Donkey Anti-Mouse IgG (H + L) (Verdünnung 1:100; Katalog-Nr. A0460, Beyotime, Shanghai, China) sichtbar gemacht, gescannt mit dem LuxScanTM 10 KB Microarray Scanner (Katalog-Nr . 100020, CapitalBio); Zur Quantifizierung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) wurde der Festkreisansatz verwendet.

Frische ganze Mäusemilzen wurden entnommen und mit einer sterilen Schere in einer Petrischale mit 10 ml vorgekühltem RPMI 1640 (Katalog-Nr. 31800, Solarbio, Peking, China) unter einem sterilen Biosicherheitsschrank in kleine Stücke zerkleinert. Die Milzgewebestücke wurden mit dem flachen Ende des Kolbens einer Spritze in kreisenden Bewegungen vorsichtig durch das 70-µm-Sieb zerdrückt, bis der Rest des Milzgewebes weiß wurde. Die Zellsuspension wurde erneut filtriert und mit überschüssigem RPMI 1640 durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 1000 U/min bei 4 °C gewaschen. Anschließend wurde das Pellet in 3 ml kaltem RBC-Lysepuffer 5 Minuten lang auf Eis resuspendiert. Nach der Inkubation wurde die Lysereaktion durch Zugabe von komplettem RPMI-Medium bis zu einem Endvolumen von 10 ml gestoppt. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen gezählt und mit komplettem RPMI-Medium auf die gewünschte Zellkonzentration resuspendiert.

Die Proliferation von Lymphozyten wurde, wie bereits berichtet, mit dem CCK8-Assay bestimmt [30, 32]. Lymphozyten von Mäusen, die mit rPocDBP-RII und PBS (5 × 104 Zellen/Well) immunisiert waren, wurden mit Concanavalin A (Con A: 2 μg/ml) oder rPocDBP-RII (10 μg/ml) in einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit flachem Boden behandelt Platten. Das komplette RPMI 1640-Medium und Con A wurden jeweils als Leerwert und Positivkontrolle verwendet. Anschließend wurden die Platten 72 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Zellproliferation wurde unter Verwendung des Cell Counting Kit-8-Assays durchgeführt und der Stimulationsindex (SI) wurde nach der folgenden Formel berechnet: SI = [(OD450 der stimulierten Zellen – OD450 der nicht stimulierten Zellen)/OD450 der nicht stimulierten Zellen] × 100 %.

Um die Reaktion von IFN-γ/IL-10-Zytokin-produzierenden T-Zellen und Gedächtnis-T-Zellen auf die rPocDBP-RII-Stimulation zu bewerten, wurden die Zellphänotypen mittels Durchflusszytometrie analysiert (Cytoflex S, Beckman Coulter, CA, USA). Die in dieser Studie verwendeten Antikörper wurden von Biolegend (San Diego, CA, USA) oder BD (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) gekauft. Die Bewertung der Reaktion von IFN-γ/IL-10-Zytokin-produzierenden Zellen erfolgte anhand etablierter Protokolle [33,34,35]. Kurz gesagt, die Zellen wurden in vollständigem RPMI 1640, das Proteine ​​von rPocDBP-RII (10 µg/ml) enthielt, resuspendiert und mit 5 × 106 Zellen/Well in 12-Well-Platten ausplattiert. Nach 18 Stunden wurden 2 × 106 Zellen in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt und in Gegenwart von PMA (50 ng/ml), Ionomycin (5 µg/ml) und Brefeldin A (10 µg/ml) 4 Stunden lang bei inkubiert 37 °C mit 5 % CO2, um T-Lymphozyten zu stimulieren und die Zytokinsekretion zu blockieren. Die Zellen wurden dann einmal in PBS gewaschen und 30 Minuten lang bei 4 °C mit CD3 (FITC), CD4 (APC) und CD8a (PE-Cy7) gefärbt. Die Zellen in jedem Röhrchen wurden erneut gewaschen und 20 Minuten lang bei 4 ° C in 200 μl 4% iger Paraformaldehydlösung fixiert. Für die 24-stündige rPocDBP-RII-Stimulation wurden die Zelloberflächenmarker für Gedächtnis-T-Zellen [CD3 (APC-Cy7), CD4 (PE), CD8a (APC), CD44 (FITC), CD62L (PE-Cy7)] eingefärbt in der gleichen Weise. Für die intrazelluläre Zytokinfärbung wurden die Zellen dann mit einem Zellpermeabilisierungskit (eBioscience) gemäß den Anweisungen des Herstellers permeabilisiert und im Dunkeln für 30 Minuten bei 4 °C mit IFN-γ (PE) und IL-10 (PE) gefärbt. jeweils. Schließlich wurden die Zellen gewaschen und vor der durchflusszytometrischen Analyse in Durchflusszytometrie-Färbepuffer resuspendiert. Die Daten wurden mit FlowJo v10 (TreeStar, LaJolla) analysiert.

Für die statistischen Analysen und die grafische Darstellung wurden GraphPad Prism (Version 8.4.2; GraphPad Software, San Diego, CA, USA) und SigmaPlot (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA) verwendet. Für den Vergleich der Mittelwerte zwischen den Stichproben wurde ein ungepaarter zweiseitiger Student-t-Test verwendet; P < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Das schematische Diagramm des gesamten experimentellen Prozesses ist in Abb. 1 dargestellt.

Schematische Darstellung des experimentellen Ablaufs. Genomische DNA wurde aus Blutproben von Patienten extrahiert, die mit Plasmodium ovale curtisi infiziert waren. Genetische Polymorphismen und natürliche Selektion des PocDBP-RII-Gens wurden durch Sequenzierung und Neutraltests untersucht. Die Variation der Kopienzahl des PocDBP-RII-Gens wurde durch qPCR untersucht. Die Proliferation von Lymphozyten in mit rPocDBP-RII immunisierten Mäusen wurde mithilfe des CCK8-Assays bestimmt. Die Ausmaße der Anti-rPocDBP-RII-Antikörperreaktion im Serum und der IFN-γ/IL-10-produzierenden T-Zellen in der Milz immunisierter Mäuse wurden mittels Protein-Microarrays bzw. Durchflusszytometrie bewertet

Um das Ausmaß der genetischen Variation in PocDBP-RII zu bestimmen, wurden 93 P. ovale curtisi-Proben für PocDBP-RII sequenziert, darunter Angola (n = 11), Kamerun (n = 6), Tschad (n = 1) und die Demokratische Republik Kongo (n = 8), Äquatorialguinea (n = 36), Gabun (n = 1), Ghana (n = 1), Guinea (n = 1), Liberia (n = 2), Malawi (n = 1). ), Mosambik (n = 1), Niger (n = 1), Nigeria (n = 14), Republik Kongo (n = 6), Sierra Leone (n = 1), Südafrika (n = 1) und Sambia ( n = 1) (Abb. 2A, B). Alle Sequenzen wurden durch MEGA7.0 ausgerichtet und auf 1143 bp (nt, 526–1668) geschnitten. Es gab fünf Haplotypen (H) und vier SNPs, darunter drei Singleton-Variablenstellen und eine Sparsamkeits-Informationsstelle. Die Haplotyp-Diversität (Hd) des PocDBP-RII-Gens betrug 0,105 und der Nukleotid-Diversitätsindex (π) betrug 0,00011 (Tabelle 2). Der π-Wert im Bereich von 0 bis 0,00106 wurde durch ein 100-bp-Schiebefenster mit einem 25-bp-Inkrement ausgewertet (Abb. 2C), wobei sich herausstellte, dass alle polymorphen Stellen im N-terminalen Bereich von PocDBP-RII konzentriert waren (nt, 601). –850).

Geografische Verteilung der Quellen der in dieser Studie verwendeten klinischen Proben von Plasmodium ovale curtisi und Sliding-Window-Plot-Analysen. AA-Karte von Afrika mit den Herkunftsländern der P. ovale curtisi-Isolate. B Die Gesamtzahl der genotypisierten Proben (n = 93) und der Prozentsatz der Proben pro Region. Sliding-Window-Plot-Analysen zeigen die Nukleotiddiversität (π) C und Tajimas D-Werte D von PocDBP-RII

Es wurde ein Neutraltest durchgeführt, um die Ursachen für den artspezifischen Phänotyp zu identifizieren. Alle diese fünf Isolate mit Basenmutation zeigten nicht-synonyme Mutationen, die einen A/C-Polymorphismus bei Nukleotid 629 (K210T), zwei T/A-Polymorphismen bei Nukleotid 751 (F251I) und einen TT/AA-Polymorphismus bei Nukleotid 752–753 (F251N) enthielten ) und ein C/G-Polymorphismus bei Nukleotid 813 (N271K) (Tabelle 3). Allerdings können weder das Verhältnis von nicht-synonymen zu synonymen Substitutionen (dN/dS oder ω) noch ein dN-dS-Wert zum Nachweis einer positiven darwinistischen Selektion verwendet werden, da die Unterschiede in einem Satz konspezifischer Sequenzen, die aus einer einzelnen Population entnommen wurden, nur repräsentativ sind Trennung von Polymorphismen im Gegensatz zu festen Substitutionen [36]. Tajimas D war negativ (Abb. 2D), aber der P-Wert war nicht signifikant (Tajimas D = – 1,6812, 0,05 < P < 0,1), was zeigt, dass die Mutationen in PocDBP-RII in dieser Studie mit dem neutralen Evolutionsmodell übereinstimmten. Die D*- und F*-Tests von Fu und Li lehnten jedoch ein neutrales Polymorphismus-Vorkommensmodell ab (D* von Fu und Li = − 2,63945, P < 0,05 und F* von Fu und Li = − 2,74087, P < 0,05) (Tabelle 2). Da die D*- und F*-Tests von Fu und Li sehr empfindlich auf jüngste Populationserweiterungen reagieren, gibt es Fälle, in denen die D*- und F*-Statistikwerte von Fu und Li negativ und signifikant sind und Tajimas D nahe Null liegt. Unter den Intra-Spezies-Tests ergaben die teilweise DNA-Sequenzierung und -Analysen eine begrenzte genetische Vielfalt von PocDBP-RII und schwache Hinweise auf natürliche Selektion.

Um CNVs im PocDBP-RII-Gen nachzuweisen, wurde die 2−∆∆Ct-Methode der relativen Quantifizierung unter Verwendung quantitativer Echtzeit-PCR mit SYBR-Green-Detektion angepasst, um die Kopienzahlen von PocDBP-RII zu berechnen [37]. Als Referenz wurde das Housekeeping-Gen PocFBPA (PlasmoDB, PocGH01_12070000) ausgewählt, das homolog zur P. vivax-Aldolase [8] (PlasmoDB, PVX_118255) ist. Um die Gültigkeit der ∆∆Ct-Berechnung [∆∆Ct = (Ct DBP-Ct FBPA) Proben – (Ct DBP-Ct FBPA) pREF1] sicherzustellen, wurde die Amplifikationseffizienz von qPCR getestet. Eine Standardkurve wurde unter Verwendung einer Reihe fünffach verdünnter Plasmid-DNA-Proben als Vorlage erstellt (Abb. 3A), wobei die qPCR-Effizienz [Effizienz = (10−1/Steigung–1) × 100 %] des Referenzgens und des Zielgens ähnlich waren ( m < 0,1) und > 90 %, was den Anforderungen der empfohlenen Verstärkungseffizienz entspricht [38]. Darüber hinaus war die in pREF2 beobachtete N-fache Kopienzahl (2−∆∆Ct) bei jeder Verdünnung offensichtlich doppelt so hoch wie die Zahl in pREF1 (Abb. 3B), was bestätigt, dass die 2−∆∆Ct-Berechnung angewendet werden konnte.

Variation der Kopienzahl im PocDBP-RII-Gen. Eine Standardkurve von qPCR zum Nachweis von PocDBP-RII und PocFBPA zur Berechnung der relativen Amplifikationseffizienz (Effv %). Die horizontale Achse stellt die Lg der DNA-Moleküle dar, die bei jeder Verdünnung dem qPCR-Reaktionssystem hinzugefügt werden, und die vertikale Achse zeigt die Ct-Werte. Der absolute Wert der Steigung lag nahe bei Null (m = 0,0632), was bestätigt, dass die Amplifikationseffizienzen von PocDBP-RII und PocFBPA ähnlich waren. B Es wurden Diagramme des Lg von DNA-Molekülen gegen die N-fache Kopienzahl erstellt, um die relative Effizienz und die PocDBP-RII-Kopienzahl in den beiden Referenzplasmiden widerzuspiegeln. C Streudiagramme, die die Schätzung der N-fachen Kopienzahl von PocDBP-RII in Plasmodium ovale curtisi-Isolaten aus verschiedenen Regionen Afrikas (n = 74) darstellen.

Von allen 93 Isolaten wurden 2 von 3 aus Ostafrika, 16 von 20 aus Westafrika, 1 von 1 aus dem südlichen Afrika und 55 von 69 aus Zentralafrika erfolgreich bestimmt. Unsere Schätzungen von PocDBP-RII CN für diese Isolate lagen zwischen 0,7 und 1,2 (Abb. 3C). In keinem Fall war der N-Fach > 1,3, was darauf hindeutet, dass alle Isolate eine Kopie des PocDBP-RII-Gens trugen. Neunzehn Proben, die die in der Methodik verwendeten Kriterien (N-fach > 0,7) nicht erfüllten, wurden von der Analyse ausgeschlossen. Das Versagen des CN-Nachweises in diesen Proben könnte durch die geringgradige Parasitämie verursacht worden sein, die dazu führte, dass zu wenig P. ovale curtisi-gDNA für die qPCR extrahiert wurde. Diese Situation trat auch bei der Berechnung der N-fachen Kopienzahl von pREF1 und pREF2 auf, wo die N-fachen Kopienzahlen eine große Instabilität aufwiesen, wenn das DNA-Molekül < 320 war (Daten nicht gezeigt). Da PocDBP-RII evolutionär stabil und frei von CNV ist und somit die Hauptvoraussetzungen für die Entwicklung eines wertvollen Antigens als Impfstoff erfüllt, bestand der nächste Schritt darin, seine Antigenität und Immunogenität sicherzustellen.

Die PCR-Produkte von PocDBP-RII wurden erfolgreich amplifiziert (Abb. 4A) und in einen pET28a-Vektor kloniert. Das resultierende Plasmid wurde in Zellen des E. coli-Stammes Rosetta (DE3) transformiert und mit IPTG induziert. Die Proteinexpression wurde durch SDS-PAGE analysiert und dann mit Coomassie-Brillantblau angefärbt (Abb. 4B). Das rPocDBP-RII wurde aus Einschlusskörpern gereinigt und das neu gefaltete Protein zeigte unterschiedliche Mobilitäten unter reduzierenden (DTT +) und nicht reduzierenden Bedingungen (DTT-), was darauf hinweist, dass die Disulfidbindungen korrekt gebildet wurden (Abb. 4C). Zur Erstellung einer Standardkurve wurde ein Bicinchoninsäure (BCA)-Assay verwendet, und die erhaltene Konzentration an gereinigtem rPocDBP-RII wurde auf 1 mg/ml geschätzt. Meerrettichperoxid (HRP)-konjugierter Anti-His-Antikörper wurde im Western Blot verwendet, um die Proteinexpression nachzuweisen, und Seren von rPocDBP-RII-immunisierten Mäusen oder PBS-immunisierten Mäusen wurden verwendet, um die Antikörperspezifität von rPocDBP-RII-immunisierten Mäusen zu untersuchen (Abb . 4D). Als Ergebnis wurde gezeigt, dass rPocDBP-RII-immunisiertes Mausserum das rPocDBP-RII-Protein spezifisch erkennt, verglichen mit einer fehlenden Erkennung in PBS-immunisiertem Mausserum (Negativkontrolle).

Expression und Reinigung von rPocDBP-RII und Nachweis von Anti-rPocDBP-RII-Antikörpern in Seren immunisierter Mäuse. Eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikation für PocDBP-RII (Pfeilspitze: ein 975-bp-Produkt). M: Markierung; Spur 1: keine Template-Kontrolle; Spur 2: DNA, extrahiert aus dem Plasma eines mit Parasiten infizierten Patienten. B SDS-PAGE-Analyse von rPocDBP-RII (Pfeilspitze: eine 39-kDa-Bande) nach Induktion mit IPTG. M: Proteinmarker; Spur 1: Zellhomogenate von E. coli Rosetta/pET28a-PocDBP-RII ohne IPTG-Induktion; Spur 2: Zellhomogenate nach IPTG-Induktion für 6 Stunden. C Coomassie-Blau-gefärbtes SDS-PAGE-Gel von eluiertem, gereinigtem und konzentriertem rPocDBP-RII vor und nach der Behandlung mit Dithiothreitol (DTT). M: Proteinmarker; Spur 1: rückgefaltetes rPocDBP-RII (DTT-); Spur 2: denaturiertes rPocDBP-RII (DTT +), das als einzelnes Bandenmuster auf SDS-PAGE mit der erwarteten Größe von 39 kDa wanderte. D Western-Blot-Analyse von rPocDBP-RII unter Verwendung eines monoklonalen Anti-HIS-Kaninchen-Antikörpers (Spur 1) oder von Antikörpern aus dem Serum von Mäusen, die mit rPocDBP-RII (Spur 2) oder PBS (Spur 3) immunisiert wurden.

Um die Antigenität von rPocDBP-RII zu bewerten, wurden die durchschnittlichen Serum-IgG-Titer antigenspezifischer Antikörper in rPocDBP-RII-immunisierten und PBS-immunisierten Mäusen mithilfe von Protein-Microarrays ermittelt. Vor der Immunisierung wurden Blutproben von Mäusen entnommen, um einen Ausgangswert vor der Immunisierung zu ermitteln und die mittlere Fluoreszenzintensität auf verschiedenen Protein-Mikroarrays zu normalisieren. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Antikörperspiegel von rPocDBP-RII im Vergleich zu PBS-immunisierten Mäusen von der Primärimmunisierung bis etwa zwei Wochen nach der letzten Immunisierung (Tag 42) allmählich anstiegen und im folgenden Monat zu sinken begannen, aber immer noch ein hohes Niveau beibehielten (Abb. 5A, B). Darüber hinaus zeigten nach drei aufeinanderfolgenden Immunisierungen mit rPocDBP-RII Serumproben von immunisierten Mäusen, die an den Tagen 42 und 70 nach der ersten Immunisierung von 1:250 auf 1:32.000 verdünnt wurden, eine ähnliche Tendenz der Reaktivität gegenüber rPocDBP-RII und des Antikörpertiters Zielantigen beträgt 1:16.000 (Abb. 5C, D).

Humorale Immunantworten bei rPocDBP-RII-immunisierten Mäusen. A Die Gesamt-IgG-Werte im Mäuseserum gegen rPocDBP-RII-Protein (n = 5) oder PBS (n = 3) wurden an den Tagen 0, 14, 28, 42 und 70 nach der Immunisierung mittels Proteinarrays gemessen. Das Falschfarbenbild eines Beispielarrays zeigt die Signalintensität. ein weißer oder roter Fleck ist intensiver als die blauen. Die Zahl oben im Bild stellt verschiedene Mäuse dar. B Quantifizierung der relativen Spotintensitäten von Duplikaten. Höhere Antikörperkonzentrationen im Serum führen zu einer stärkeren mittleren Fluoreszenzintensität (MFI). C-Serum von immunisierten Mäusen wurde in zweifacher Verdünnungsreihe (von 1:250 bis 1:32.000) doppelt angesetzt. D Linearität und Reproduzierbarkeit dieser Daten werden in der Grafik dargestellt

Der Lymphozytenproliferationstest wurde verwendet, um die Immunogenität von rPocDBP-RII bei der Induktion antigenspezifischer T-Zell-Reaktionen zu bewerten. Im Vergleich zur PBS-immunisierten Gruppe hatten Splenozyten von rPocDBP-RII-immunisierten Mäusen eine stärkere Fähigkeit, sich als Reaktion auf die Stimulation von rPocDBP-RII zu teilen. Darüber hinaus induzierte das rPocDBP-RII-Protein eine aggressivere proliferative Reaktion in Splenozyten als ConA (Positivkontrolle) (Abb. 6B). Um die Funktion von rPocDBP-RII-spezifischen T-Zellen zu beurteilen, wurde der Anteil der IFN-γ/IL-10-Zytokin-produzierenden Zellen bei rPocDBP-RII-Stimulation durch intrazelluläre Zytokinfärbung analysiert (Abb. 6A). Durch die Stimulierung der Splenozyten immunisierter Mäuse in vitro wurde festgestellt, dass der Spiegel an IFN-γ-produzierenden T-Zellen in der mit rPocDBP-RII immunisierten Gruppe signifikant höher war (CD4+, 2,09 ± 0,42 %; CD8+, 8,7 % ± 1,15 %). als bei den PBS-immunisierten Mäusen (CD4+, 0,42 ± 0,13 %, P < 0,05; CD8+, 1,24 ± 0,62 %, P < 0,05) (Abb. 6C). Im Gegensatz dazu konnte die Stimulation mit rPocDBP-RII die Größe der IL-10-produzierenden CD4+ T-Zellen (rPocDBP-RII, 0,2 ± 0,09 %; PBS, 0,08 ± 0,04 %, P > 0,05) oder CD8+ T-Zellen (rPocDBP- RII, 1,43 ± 0,32 %; PBS, 1,49 ± 0,72 %, P > 0,05) (Abb. 6D). Diese Daten legen nahe, dass die Immunisierung mit rPocDBP-RII in der Lage war, IFN-γ-produzierende T-Zellen zu induzieren, und dass die zelluläre Immunität möglicherweise auch am rPocDBP-RII-vermittelten Schutz gegen eine P. ovale curtisi-Infektion beteiligt ist.

IFN-γ/IL-10-produzierende T-Zell-Reaktionen in rPocDBP-RII-immunisierten Mäusen. Eine Durchflusszytometrie-Gating-Strategie für IFN-γ/IL-10-produzierende T-Zellen auf dem rPocDBP-RII-Antigen. B Lymphoproliferative Aktivität von Splenozyten, die aus der Versuchsgruppe und der PBS-Gruppe isoliert wurden, Concanavalin A (Con A) diente als Positivkontrolle. Messung der IFN-γ-produzierenden C- und IL-10-produzierenden D-CD4+- und CD8+-T-Zellspiegel in Mäusen mittels Durchflusszytometrie. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt. Die P-Werte wurden mithilfe des Student-t-Tests berechnet. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen werden in der Grafik angezeigt: * P < 0,05, nicht signifikante (ns) Unterschiede werden angezeigt (P > 0,05)

Da IFN-γ-produzierende Effektor-/Effektor-Gedächtniszellen eine Schlüsselrolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung des durch CD4+-T-Zellen oder CD8+-T-Zellen vermittelten Langzeitschutzes gegen Malaria spielen [39], wurden gesteuerte CD4+- und CD8+-Splenozyten auf die Expression von analysiert CD62L und CD44. CD4+- und CD8+-T-Zellen in den Splenozyten von Mäusen können in vier naive/Gedächtnis-T-Zell-Untergruppen unterteilt werden [40]: CD44int/lowCD62L+ naiv, CD44highCD62L+ CM, CD44highCD62L− EM und CD44int/lowCD62L− EMRA (Abb. 7A). Sowohl das phänotypische Muster von CD4+- als auch CD8+-T-Zellen in der mit rPocDBP-RII immunisierten Gruppe zeigte einen höheren und signifikanten Prozentsatz an TEM (Abb. 7B), wohingegen TCM nur in der Untergruppe antigenspezifischer CD8+-T-Zellen einen signifikanten Unterschied zeigte (Abb . 7C). Darüber hinaus zeigte unsere Studie, dass rPocDBP-RII einen höheren Anteil an TEM in CD4+ T-Zellen (CD4+, 17,26 % ± 1,41 %; CD8+, 5,03 % ± 0,78 %) und einen höheren Anteil an TCM in CD8+ T-Zellen (CD4+, 8,03 % ± 0,98 %; CD8+, 21,28 % ± 4,18 %. Im Allgemeinen schienen CD4+CD44highCD62L− T-Zellen und CD8+CD44highCD62L+ T-Zellen, die durch Stimulation von rPocDBP-RII aktiviert wurden, zu überwiegen.

Häufigkeit von Gedächtnis-T-Zellen als Reaktion auf die Stimulation des rPocDBP-RII-Antigens mittels Multiparameter-Durchflusszytometrie. A Die repräsentative Gating-Strategie zur Identifizierung von T-naiven Zellen (Tnaive, CD44int/low CD62L+), zentralen T-Gedächtniszellen (TCM, CD44high CD62L+), T-Effektor-Gedächtniszellen (TEM, CD44high CD62L−) und terminal differenzierten T-Zellen (TEMRA, CD44int /low CD62L−). Die Konturdiagramme oben zeigen CD4+-T-Zellen und die Konturdiagramme unten zeigen CD8+-T-Zellen. Prozentualer Vergleich von TEM (B) und TCM (C) in CD4+- und CD8+-T-Zellen nach Stimulierung der Splenozyten von rPocDBP-RII-immunisierten und PBS-immunisierten Mäusen durch rPocDBP-RII in vitro

In jüngster Zeit sind Nicht-Falciparum- und Nicht-Vivax-Malaria in den Fokus der wissenschaftlichen Gemeinschaft gerückt, da sich die Muster der Malariaübertragung ändern und P. falciparum gut unter Kontrolle ist [41]. Hier zeigen wir, dass PocDBP-RII im Vergleich zu anderen Impfstoffkandidaten für P. vivax wie PvEBP, PvDBP-RII, PvAMA1 und PvMSP3α (π = 0,019) eine geringere Nukleotiddiversität (π = 0,00011) aufwies [42, 43]. Die Proteinsequenzanalyse ergab, dass es in PocDBP-RII drei polymorphe Reststellen gab, von denen die Aminosäureveränderung an Position 251 trimorph war (F251I, F251N) und mit einer Häufigkeit von 3,2 % auftrat. Interessanterweise ergab ein Cluster-Alignment homologer Sequenzen, dass die Aminosäure PvDBP-RII-F261, die homolog zu PocDBP-RII-F251 ist, zuvor auch Polymorphismus in P. vivax-Isolaten aus Malaysia aufwies [44]. Die Bedeutung dieser Mutation muss zur weiteren Bestätigung experimentell beurteilt werden.

In neutralen Evolutionstests ist es etwas paradox, dass Tajimas D und Fu und Lis D* und F* beide negative Werte zeigten, aber nur Fu und Lis D* und F* statistische Signifikanz erreichten. Ein ähnliches Datenmuster wurde bei PvRBP1a-ecto beobachtet [42]. Die Schätzung der genetischen Differenzierung (FST) und die Haplotyp-Netzwerkanalyse zeigten, dass es in der betrachteten Population keinen Differenzierungsgrad gab (Daten nicht angezeigt). Wenn jedoch eine Populationserweiterung zu einem Überschuss an seltenen Allelen führen würde, würden eine geringe Nukleotiddiversität und hohe Haplotypen gleichzeitig existieren [45]. Doch die Tatsache, dass wir nur fünf Haplotypen fanden, kann das Vorhandensein natürlicher Selektion nicht erklären. Die genetische Diversitätsanalyse von PocDBP-RII zeigte, dass diese Region ohne Amplifikation konserviert ist und eine attraktive Zielregion für die Impfstoffentwicklung darstellt. Allerdings werden in der zukünftigen Forschung größere globale Stichproben und leistungsfähigere Techniken erforderlich sein, um unsere Ergebnisse zu untermauern.

Antigene mit geringer genetischer Diversität und konservierten Aminosäurestellen können als potenzielle Ziele für schützende Immunantworten und Impfstoffkandidaten dienen [46]. Der Beitrag starker neutralisierender Immunantworten und schützender zellulärer Immunität zur Malariaprävention wurde kürzlich im Zusammenhang mit der Impfstoffentwicklung untersucht [47,48,49]. Die serologische Reaktion deutete darauf hin, dass rPocDBP-RII das Ziel immunologisch aktiver Antikörper sein könnte. Obwohl die Antikörpertiter nach zweimonatiger Immunisierung abnahmen, war der von den immunisierten Mäusen erhaltene Antikörperspiegel immer noch hoch. Darüber hinaus sind geeignete Adjuvantien ausreichend wirksam bei der Induktion hoher Antikörpertiter [50], und die Langlebigkeit und Zusammensetzung der zellulären Immunantwort scheint mehr Aufmerksamkeit zu verdienen. Ein wirksamer Impfstoff löst eine humorale Immunantwort zur Entwicklung von Malaria-Antikörpern durch B-Zellen und eine zelluläre Immunantwort durch die Produktion antigenspezifischer Lymphozyten durch T-Zellen aus [51]. Eine ausreichende Menge der Plasmodium-Parasiten-spezifischen Antikörper und CD4+- und CD8+-T-Zellen kann eine schützende Immunität im Blutstadium vermitteln [52]. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Immunisierung mit rPocDBP-RII in der Lage war, IFN-γ-produzierende T-Zellen anstelle von IL-10-produzierenden T-Zellen zu induzieren, um an der rPocDBP-RII-vermittelten zellulären Immunität gegen eine P. ovale curtisi-Infektion teilzunehmen. Mehrere Studien haben wiederholt gezeigt, dass IFN-γ für die Parasitenbeseitigung und die Schutzwirkung unerlässlich ist [53, 55]. Bei einer Malariainfektion ist IL-10 ein starker Suppressor mehrerer entzündungsfördernder Zytokine wie IFN-γ, wodurch es die zellvermittelte Immunantwort beeinträchtigt [56, 57].

Obwohl IFN-γ von vielen Zellen des Immunsystems sekretiert werden kann, wird die Produktion langlebiger Malaria-spezifischer IFN-γ-Gedächtnisreaktionen hauptsächlich von Gedächtnis-T-Zellen gesteuert (58, 60). Diese Studie bestätigt, dass sowohl CD4+ T-Zellen als auch CD8+ T-Zellen entscheidende Produzenten von IFN-γ waren, CD8+ T-Zellen zeigten jedoch eine höhere TCM-Rate, während CD4+ T-Zellen einen höheren Anteil an TEM aufwiesen. Das Ergebnis stimmte nicht mit der Schlussfolgerung überein, dass CD4+ T-Zellen die Hauptquelle von IFN-γ als Reaktion auf PvMSP1P-19 waren [38], denn obwohl das meiste Milz-IFN-γ im Frühstadium der Infektion von CD4+ T-Zellen produziert werden kann, Im Spätstadium könnte IFN-γ aus CD8+ T-Zellen aufgrund der Kompensation durch andere Zelltypen verstärkt werden [19]. Der mit der Antigenpersistenz verbundene Anstieg von CD4+ TEM kann durch die Förderung ihrer Proliferation und durch die Programmierung der Produktion von TEM aus TCM verursacht werden [21, 58]. Alles in allem könnten CD44-High-Memory-T-Zellen einen großen Anteil an Effektorzellen enthalten, die IFN-γ produzieren, was möglicherweise zum verbesserten Schutz beigetragen hat. Darüber hinaus ist zu beachten, dass sich diese Arbeit weitgehend auf die Immunantwort von T-Zellen konzentriert; Allerdings wird es oft wünschenswert sein, gleichzeitig Gedächtnis-B-Zellen (MBCs) und langlebige Plasmazellen (LLPCs) zu messen, um einen langlebigen und wirksamen Impfstoffkandidaten zu entwickeln [35, 61]. Zusammenfassend untersuchte diese Studie neue Informationen zur Eignung von rPocDBP-RII als neuartiger Impfstoffkandidat für P. ovale curtisi.

Diese Studie bestätigt, dass das PocDBP-RII-Gen, das eine geringe genetische Diversität und schwache Hinweise auf natürliche Selektion aufweist, unter P. ovale curtisi-Parasiten konserviert ist, die aus afrikanischen Isolaten gesammelt wurden. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass das rPocDBP-RII-Antigen bei Mäusen sowohl humorale als auch von T-Zellen abgeleitete IFN-γ-abhängige zelluläre Reaktionen effizient hervorruft und aufrechterhält. Diese Ergebnisse legen nahe, dass rPocDBP-RII als potenzieller Impfstoffkandidat dienen könnte, es ist jedoch unbedingt erforderlich, dass zukünftige Studien durchgeführt werden, um die Wirksamkeit von rPocDBP-RII weiter zu beurteilen.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

Plasmodium ovale curtisi Duffy-Bindungsproteindomänenregion II

Polymerase Kettenreaktion

Nukleotid

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20

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Die Autoren danken den örtlichen Gesundheitsbehörden des Jiangsu Provincial Hospital in China und dem Jiangsu Institute of Parasitic Diseases für ihre Unterstützung bei der Bereitstellung klinischer Proben für Plasmodium ovale. Wir danken den Mitgliedern des Hongmei Jiao Laboratory herzlich für die Zellanalyse, die für diese Arbeit von wesentlicher Bedeutung war.

Diese Studie wurde von der National Nature Science Foundation of China (Nr. 82072297), dem Jiangsu Province Capability Improvement Project through Science, Technology and Education (Nr. ZDXYS202207) und dem Six Talent Peaks Project in der Provinz Jiangsu (2019-YY-065) unterstützt ), das High Level Talent Support Project der Yangzhou University und das Graduate Research and Practice Innovation Program der Provinz Jiangsu (KYCX22_3564).

Zhenyu Ren, Qiyang Shi und Simin Xu haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Abteilung für Pathogene Biologie und Immunologie, Medizinische Fakultät, Yangzhou-Universität, Yangzhou, 225009, Volksrepublik China

Zhenyu Ren, Simin Xu, Jiahui Xu, Yi Yin, Zhijie Lin, Xinlong He, Jingyuan Lu, Yinyue Li, Wenwen Zhang, Jiali Liu, Yun Yang und Feng Lu

Schlüssellabor der Nationalen Gesundheitskommission für die Kontrolle und Prävention parasitärer Krankheiten, Schlüssellabor der Provinz Jiangsu für Parasiten- und Vektorkontrolltechnologie, medizinisches Schlüssellabor der Provinz Jiangsu, Jiangsu-Institut für parasitäre Krankheiten, Wuxi, 214064, Volksrepublik China

Qiyang Shi, Sui Xu, Xiaoqin Ma, Yaobao Liu, Guoding Zhu und Jun Cao

Changshu Second People's Hospital, Suzhou, 215500, Jiangsu, Volksrepublik China

Simin Xu

Abteilung für medizinische Umweltbiologie und Tropenmedizin, School of Medicine, Kangwon National University, Chuncheon, Gangwon-do, 24341, Republik Korea

Eun-Taek Han

Angegliedertes Krankenhaus der Yangzhou-Universität, Yangzhou, 225000, Volksrepublik China

Feng Lu

Jiangsu Key Laboratory of Experimental & Translational Non-Coding RNA Research, School of Medicine, Yangzhou University, Yangzhou, 225009, Volksrepublik China

Zhijie Lin & Feng Lu

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FL, JC und EH haben das Manuskript entworfen und überarbeitet. ZR und JX trugen zum proteinrelativen Experiment bei und verfassten das Manuskript. QS, SX und YY trugen zur Zielsequenzierung bei. SX, YL und GZ trugen zur Probensammlung und gDNA-Extraktion bei. XM, XH, JL, YL, JL, WZ und YY nahmen an dem Experiment teil und analysierten die Daten. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Jun Cao oder Feng Lu.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Jiangsu Provincial Key Laboratory on Parasite and Vector Control Technology, dem Jiangsu Institute of Parasitic Diseases (IRB00004221) und der School of Medicine der Yangzhou University (Yangzhou, China, YXYLL-2020-59) genehmigt. Die Teilnehmer unterzeichneten vor der Aufnahme in die Studie eine Einverständniserklärung.

Unzutreffend.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Der Creative Commons Public Domain Dedication-Verzicht (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) gilt für die in diesem Artikel zur Verfügung gestellten Daten, sofern in einer Quellenangabe für die Daten nichts anderes angegeben ist.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ren, Z., Shi, Q., Xu, S. et al. Auslösung einer von T-Zellen abgeleiteten IFN-γ-abhängigen Immunität durch die hochkonservierte Plasmodium ovale curtisi Duffy-Bindungsproteindomänenregion II (PocDBP-RII). Parasites Vectors 16, 269 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05897-9

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Eingegangen: 24. Mai 2023

Angenommen: 27. Juli 2023

Veröffentlicht: 08. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05897-9

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