Immunologisches Profil von Mäusen, die mit einem polyvalenten Virosom immunisiert wurden

Virology Journal Band 20, Artikelnummer: 187 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das Influenza-A-Virus (IAV) verursacht Atemwegserkrankungen bei Schweinen und stellt ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit dar. Die Impfung von Schweinen ist die erfolgreichste Maßnahme, um die Auswirkungen der Krankheit in den Beständen abzumildern. Das auf Influenza basierende Virosom ist ein wirksamer immunmodulierender Träger, der den natürlichen Antigenpräsentationsweg nachbildet und aufgrund seiner Reinheit und Biokompatibilität ein Verträglichkeitsprofil aufweist.

Ziel dieser Studie war die Entwicklung eines polyvalenten Virosom-Influenza-Impfstoffs, der die Hämagglutinin- und Neuraminidase-Proteine ​​enthält, die aus den Schweine-IAVs (swIAVs) der Subtypen H1N1, H1N2 und H3N2 stammen, und die Untersuchung seiner Wirksamkeit bei Mäusen als potenzieller Impfstoff für Schweine. Mäuse wurden mit zwei Impfstoffdosen (1 und 15 Tage) intramuskulär und intranasal immunisiert. 21 Tage und acht Monate später nach der zweiten Impfdosis wurden die Mäuse eingeschläfert. Untersucht wurden die humoralen und zellulären Immunantworten bei Mäusen, die intranasal oder intramuskulär mit einem polyvalenten virosomalen Influenza-Impfstoff geimpft wurden.

Nur die intramuskuläre Impfung induzierte hohe Titer der Hämagglutinationshemmung (HI). Serokonversion und Seroprotektion (> 4-facher Anstieg der HI-Antikörpertiter, Erreichen eines Titers von ≥ 1:40) wurden bei 80 % der Mäuse (intramuskulär geimpfte Gruppe) 21 Tage nach der Auffrischungsimpfung erreicht. Acht Monate nach der Impfung wurden virusneutralisierende Antikörpertiter gegen IAV nachgewiesen, was auf eine langanhaltende Immunität hinweist. Insgesamt zeigten mit dem Virosom immunisierte Mäuse eine größere Fähigkeit der B-, Effektor-T- und Gedächtnis-T-Zellen aus der Milz, auf die Antigene H1N1, H1N2 und H3N2 zu reagieren.

Alle Ergebnisse zeigten eine wirksame Immunantwort gegen IAVs bei Mäusen, die mit einem polyvalenten Influenza-Impfstoff auf Virosombasis geimpft wurden.

Das pandemische Influenzavirus H1N1 2009 (H1N1pdm09) verdeutlicht deutlich das Potenzial von Influenza-A-Viren (IAVs), Morbidität und Mortalität in der menschlichen Bevölkerung auf globaler Ebene zu verursachen, sowie die Bedeutung von Schweinen für die Entwicklung zoonotischer Viren [1] . Schweine sind anfällig für Infektionen sowohl mit Vogel- als auch mit menschlichen IAVs und können daher als „Mischgefäß“ für die Entstehung neuer Viren durch Neuordnung von Influenza-Gensegmenten dienen [2]. IAV ist bei Schweinen weltweit endemisch, wobei mehrere genetisch und antigenisch unterschiedliche Viruslinien der Subtypen H1N1, H1N2 und H3N2 in verschiedenen geografischen Regionen zirkulieren [3, 4]. Klinisch verursacht eine Influenzavirus-Infektion eine akute Atemwegserkrankung, die durch Fieber, Lethargie, Husten, Appetitlosigkeit und Nasenausfluss gekennzeichnet ist. Das IAV stört das normale Abwehrsystem der Atemwege und kann zu sekundären bakteriellen Infektionen führen [5].

Die wirksamste Maßnahme zur Linderung und Kontrolle der mit IAV verbundenen Morbidität und Mortalität in Schweinepopulationen ist die Impfung. Die Schweinegrippeimpfung ist für die menschliche Gesundheit gleichermaßen wichtig, da sie die IAV-Übertragung von Schwein zu Mensch und von Mensch zu Schwein reduziert und so die Wahrscheinlichkeit von Pandemierisiken und der Entstehung neuer Stämme verringert [2, 6]. In Brasilien basiert der derzeit zugelassene kommerzielle IAV-Impfstoff für Schweine auf dem gesamten inaktivierten H1N1pdm09-Virus (WIV). Der durch diesen Impfstoff erreichte Schutz wird hauptsächlich durch die Induktion von Antikörpern vermittelt, die auf die viralen Glykoproteine ​​Hämagglutinin (HA) und in geringerem Maße auf die Neuraminidase (NA) abzielen [7, 8]. Für einen hochwirksamen Impfstoff müssen die Impfantigene jedoch eine enge Antigenübereinstimmung mit den zirkulierenden IAVs in Schweinebeständen aufweisen [9, 10].

Die Überwachung von IAV bei Schweinen durch genetische und antigenische Charakterisierung ist für die Auswahl von Impfstoffkandidaten äußerst wichtig. Kürzlich wurde eine große genetische Vielfalt von IAV in der brasilianischen Schweinepopulation festgestellt, was Auswirkungen auf die Entwicklung von Kreuzschutzimpfstoffen haben könnte [11]. In diesem Sinne könnten die im Land verfügbaren IAV-Impfstoffe für Schweine einen begrenzten oder fehlenden Schutz gegen die derzeit im Umlauf befindlichen genetisch unterschiedlichen Schweine-IAVs bieten. Darüber hinaus haben IAVs die Fähigkeit, der Immunantwort des Wirts durch Mechanismen zu entgehen, die als Antigendrift und Antigenverschiebung bekannt sind und eine regelmäßige Aktualisierung der Viren, aus denen der Impfstoff besteht, erfordern, um sie an die zirkulierenden Viren anzupassen [12].

In den letzten Jahren wurden mehrere Studien mit dem Ziel durchgeführt, umfassend schützende Impfstoffe zu entwickeln, die sowohl humorale [13, 14] als auch zelluläre Immunantworten [3, 7, 15, 16, 17] auslösen. Im Allgemeinen zielen diese Impfstoffe auf antigenkonservierte Epitope auf dem HA ab [18,19,20], die von einem virusähnlichen Partikel (VLP) exprimiert werden [21]. Dennoch hat keine der vorgeschlagenen Lösungen einen praktischen Impfstoff hervorgebracht, der einen breiten heterosubtypischen Schutz induziert oder die gewünschte sterilisierende Immunität erreicht. Ein umfassender Schutz gegen IAVs kann entweder durch polyvalente Impfstoffe mit gemischten subtypspezifischen Immunogenen oder durch die Verwendung eines guten Immunogens erreicht werden, das bei zirkulierenden IAV-Subtypen konserviert ist [8]. Ein polyvalenter Influenza-Impfstoff könnte die inhärenten Einschränkungen von Influenza-Impfstoffen verringern, da diese gegen verschiedene Influenzaviren schützen sollen, die in Schweineherden zirkulieren [17, 22]. Um eine wirksame Immunität durch Immunisierung zu erreichen, muss das Ziel virusneutralisierender Antikörper außerdem antigenisch mit den zirkulierenden IAVs übereinstimmen, die bei Schweinen aus Isolaten verschiedener Abstammungslinien der Subtypen H1N1, H1N2 und H3N2 bestehen (23, 24).

Virosomen sind VLPs, die in vitro aus gereinigten Hüllkomponenten hergestellt werden; Dennoch fehlen ihnen das genetische Material und die internen Proteine ​​des einheimischen Virus. Influenza-Virosomen kombinieren die technischen Vorteile einer gut regulierten Zusammensetzung mit den immunologischen Vorteilen von VLPs [25]. In die Phospholipiddoppelschicht der Virosomen sind die funktionellen IAV-Hüllglykoproteine ​​HA und NA eingebaut. Diese viralen Proteine ​​verleihen den virosomalen Formulierungen nicht nur strukturelle Stabilität und Homogenität, sondern tragen auch erheblich zu den immunologischen Eigenschaften der Virosomen bei, die sie von anderen liposomalen Systemen unterscheiden [26]. Die voll funktionsfähige Fusionsaktivität von Virosomen, die das HA-Protein enthalten, ermöglicht die rezeptorvermittelte Aufnahme und natürliche intrazelluläre Verarbeitung des Antigens und löst dadurch sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten aus [27]. In dieser Studie wurde ein trivalenter virosomaler swIAV-Impfstoff basierend auf den Viren H1N1pdm, H1N2 und H3N2 unter Verwendung eines dialysierbaren kurzkettigen Phospholipids (1,2-Dicaproyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin, DCPC) als Lösungsvermittler konstruiert Dieses Tensid bietet die beste Leistung für die Solubilisierung von Viren. Es behält die Funktionalität der Hüllproteine ​​bei und wird während der Virosomproduktion durch Dialyse vollständig entfernt [28]. Darüber hinaus wurde die Wirksamkeit von Virosomen bei Mäusen durch Messung der zellulären Immunantwort und der Serumantikörperantwort gegen die IAV-Impfstoffstämme nachgewiesen.

Für die Herstellung des Influenza-Impfstoffs wurden drei aus Schweinen isolierte IAVs ausgewählt: A/swine/Brazil/025 − 15/2015 1 A.3.3.2 (H1N1pdm; NCBI GenBank Accession HA = MH559931 und NA = MH559933; BRMSA 1710), A/swine/Brazil/223-15-1/2015 1B.2.4 (H1N2; NCBI GenBank Accession HA = MH560035 und NA = MH560037; BRMSA 1698) und A/swine/Brazil/028-15-8/2015 (H3N2; NCBI GenBank Accession HA = MH559963 und NA = MH559965; BRMSA 1697). Laut Zhang und Gauger wurden H1N1- und H1N2-Virusproben in SPF-embryonierten Hühnereiern (Spezifischer Krankheitserreger frei) vermehrt, und das H3N2-Virus wurde in Zellen der Madin-Darby Canine Kidney (MDCK; BCRJ) inokuliert [29]. Um das Vorhandensein von IAV zu bestätigen, wurden der aus Eiern gewonnene Zellüberstand und die Chorioallantoisflüssigkeit mittels Hämagglutinationsassay [30] und RT-qPCR [31] getestet.

Ungefähr 1 l jedes Virus wurde einzeln durch tangentiale Ultrafiltration unter Verwendung einer Flusspumpe konzentriert, die an eine Kassette gekoppelt war, die eine Dialysemembran aus Polyethersulfon (PES) mit einem Cut-off von 100 kDa (Vivaflow 200 System, Sartorius, Deutschland) enthielt. Anschließend wurden 50 ml jedes Viruskonzentrats 4 Stunden lang bei 4 °C und 100.000 xg ultrazentrifugiert (Optima LE 80 K, Beckman Coulter, USA). Die Überstände wurden abgelassen und die Pellets jedes Virus wurden auf ein Endvolumen von 5 ml in TNE-Puffer (10 mM Tris, 100 mM NaCl und 1 mM EDTA, pH 7,4) verdünnt. Die konzentrierten Viren wurden durch einen Hämagglutinationstest titriert [30] und der Hämagglutiningehalt wurde durch SDS-PAGE (NuPAGE™ Bis-Tris, Thermo Fisher, USA) unter Verwendung einer Acrylamidgelplatte (4–12 %) und Silberfärbung gemäß bestimmt Empfehlungen des Herstellers. Die HA-Konzentration wurde aus der Intensität der Banden (erhalten mit der ImageJ-Software) unter Verwendung einer Gleichung berechnet, die aus einer Standardkalibrierungskurve von Albumin erhalten wurde.

Das multivalente Virosom wurde nach de Jonge, Leenhouts [32] mit Modifikationen hergestellt. Kurz gesagt wurde das gleiche Volumen jedes Virus gemischt (1:1:1) und in einer 200 mM Lösung von 1,2-Dicaproyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DCPC, Avanti Polar Lipids, USA) verdünnt. Nach sanfter Homogenisierung wurden die gepoolten Viren im TNE-Puffer weiter 1:2 (v/v) verdünnt und die endgültige Mischung 30 Minuten lang in einem Eisbad aufbewahrt, um die Auflösung der Virushüllen sicherzustellen. Anschließend wurde die Mischung 30 Minuten lang bei 4 °C und 100.000 xg ultrazentrifugiert, um die viralen Nukleokapside zu entfernen. Der Überstand wurde in einem Zellulosedialyseröhrchen (Cut-off 10 kDa, SpectraPor, USA) 48 Stunden lang bei 4 °C ausgiebig gegen TNE-Puffer dialysiert, um das Tensid (DCPC) zu entfernen, was zur Selbstorganisation der Virosomvesikel führte . Anschließend wurden die physikalisch-chemischen Eigenschaften der dialysierten Virosomformulierung bestimmt, indem die Partikelgröße und das Zetapotential durch dynamische Laserstreuung und Laser-Doppler-Elektrophorese (Zetasizer, Malvern) gemessen wurden. Der HA-Antigengehalt von H1N1, H1N2 und H3N2 wurde durch SDS-PAGE bestimmt.

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde verwendet, um die Morphologie und Ultrastruktur der Virosomen mit dem Mikroskop JEOL JEM-1011 (Jeol, Japan) zu untersuchen. Die Proben wurden pur oder 50 % verdünnt in Reinstwasser verwendet. Vor der Analyse wurden 3 µL Virosomsuspension in ein mit Formvar® bedecktes Kupfergitter gegeben. Die Kupfergitter wurden fixiert und nach vollständiger Trocknung mit 1 % Osmiumtetroxid-Dampf kontrastiert. Dazu wurden 40 µL Osmiumtetroxid 40 Minuten lang auf den Boden einer Petrischale mit den Kupfergittern gegeben. Virosomen wurden mit einer UltraScan®-Kamera digitalisiert, die mit der Computersoftware Digital Micrograph 3.6.5® (Gatan, USA) verbunden war. Um jeden Zweifel darüber auszuschließen, was Virosomen und was Artefakte aus dem Kontrast mit 1 % Osmiumtetroxid waren, wurde während der Analyse eine Negativkontrolle erstellt, die nur hochreines Wasser und Osmiumtetroxid verwendete [33].

Um die Infektiosität des Virosoms zu bewerten, wurden embryonierte Hühnereier damit inokuliert und 4 Tage lang bei 37 °C inkubiert. Virosom wurde auch in MDCK-Zellen inokuliert und 7 Tage lang überwacht.

Für die In-vitro-Zytotoxizitätstests wurden immortalisierte Makrophagenlinien (RAW 264.7-Zellen, BCRJ-0212) in vollständigem Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Invitrogen) kultiviert, das so modifiziert war, dass es 4 mM GlutaMAX (Gibco), 4500 mg/L Glucose und 1 mM enthielt Natriumpyruvat (Sigma-Aldrich) und 1500 mg/L Natriumbicarbonat (Sigma-Aldrich) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (Sigma-Aldrich). RAW 264.7-Zellen wurden kultiviert und bei 37 °C und 5 % CO2 gehalten. Nach der Bildung der Zellmonoschicht wurden die anhaftenden Zellen durch Abschaben abgelöst. Zunächst wurden RAW 264.7-Zellen (2 × 105 Zellen/Well) in 96-Well-Platten ausgesät, 24 Stunden lang zur Adhäsion kultiviert und dann mit verschiedenen Verdünnungen der Virosomformulierung (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 und 1:256, v/v) für 24, 48 und 72 Stunden. Dieses Verfahren wurde für verschiedene Passagen der Zellkultur wiederholt, bis die gewünschte Probengröße (n = 8) erreicht war. Die Kontrollzellen erhielten das gleiche Volumen eines einfachen Liposoms (hergestellt mit Phospholipiden – Lipoid® S100, Lipoid). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem MTT-Assay (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, Sigma-Aldrich) gemessen. Am Ende jeder Inkubationszeit wurde das Medium entfernt und die Zellen zweimal mit DPBS (Sigma-Aldrich) gewaschen und 3 Stunden lang mit 5 mg/ml MTT-Lösung bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die ausgefällten Formazankristalle in 200 µL Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma-Aldrich) gelöst. Die optischen Dichten (OD) wurden bei 540 nm mit einem Multiskan™ FC Microplate Photometer (Thermo Fisher Scientific) gemessen. Die für unbehandelte Zellen (Negativkontrolle) aufgezeichneten Absorptionswerte stellen 100 % der Zelllebensfähigkeit dar und wurden als Referenz zur Berechnung des Prozentsatzes der Zelllebensfähigkeit in Gegenwart jeder Probenkonzentration verwendet. Eine komplementäre Zytotoxizitätsanalyse wurde unter Verwendung des Enzyms Terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) und des Propidiumiodid (PI)-Färbekits (APO-DIRECT™, BD Biosciences) durchgeführt. RAW 264.7-Zellen wurden ausplattiert und mit den Virosomenverdünnungen (1:32 und 1:64) wie oben beschrieben behandelt. Der Test wurde gemäß den Richtlinien des Herstellers 24, 48 und 72 Stunden nach der Exposition gegenüber den Virosomen durchgeführt [33]. Das Färbeprotokoll bestand aus der Inkubation der Zellen mit dem Enzym TdT-FITC und der Färbung mit Propidiumiodid. Nach 24 und 48 Stunden Exposition wurden die Zellen mit einem Durchflusszytometer (Accuri C6 Plus, Becton-Dickinson, USA) analysiert und der Prozentsatz intakter Zellmembranen pro Gruppe bestimmt. Der Prozentsatz lebender Zellen wurde aus den Fluoreszenzmesswerten berechnet, die gemäß den Kit-Anweisungen definiert wurden.

Die Protokolle und die Verwendung von Tieren für diese Forschung entsprachen dem Animal Use Ethics Committee von Embrapa Swine and Poultry (Protokollnummer 001/2016). C57BL/6-Mäuse (weiblich, 6–8 Wochen alt) wurden unter SPF-Bedingungen aufgezogen und wie folgt in drei Gruppen eingeteilt: nicht geimpfte Kontrolle (NV, n = 20), intranasale geimpfte (5 µL/Nasenloch oder 10 µL/Tier). , IN, n = 20), intramuskulär geimpft (100 µL/Tier, IM, n = 20). Eine zusätzliche Gruppe, nicht geimpfte Liposomenkontrolle (n = 20), diente als Kontrolle für Virosomen. Die G4-Gruppe zeigte keinen Unterschied in den durchgeführten Analysen im Vergleich zu den Tieren in der NV-Gruppe (Daten nicht gezeigt). Der Formulierung wurde ein mukoadhäsives Adjuvans (Carboxymethylcellulose – CMC) (0,125 %, m/v) für die intranasale Verabreichung und Emulsigen-D® (MVP Adjuvants, USA) für die intramuskuläre Verabreichung (20 %, v/v) zugesetzt [34]. ]. Das Versuchsprotokoll bestand aus der Verabreichung von zwei Dosen des Impfstoffs im Abstand von 2 Wochen (Tage 1 und 15). 21 Tage (Tag 36) und acht Monate später (Tag 255) nach der zweiten Impfstoffdosis wurden zehn Tiere/Gruppe aus allen drei Gruppen durch intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital (80 µg/g Körpergewicht) eingeschläfert.

Zur Blutentnahme wurden Mäuse mit intraperitonealem Ketamin-Xylazin (Ketamin 60 µg/g Körpergewicht und Xylazin 10 µg/g Körpergewicht) anästhesiert. Blutproben wurden durch retroorbitale Blutung an den Tagen 0 (vor der Impfung), 3 und 17 (zwei Tage nach jeder Immunisierung) entnommen. Um die mögliche Toxizität des Impfstoffs zu beurteilen, wurde eine Quantifizierung biochemischer Marker aus den Serumproben durchgeführt und dabei die Leber- (AST und ALT) und Nierenfunktionen (Harnstoff und Kreatinin) bewertet. Diese Tests wurden mit kolorimetrischen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Labtest, Brasilien) durchgeführt.

Für die histopathologische Analyse wurden Leber-, Nieren- und Lungengewebeproben bei der Autopsie entnommen und mit 4 % gepuffertem Paraformaldehyd fixiert, in einer abgestuften Reihe von Ethanol dehydriert, in Paraffin eingebettet und bei 4 μm geschnitten. Dieses Material wurde mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) gefärbt. Darüber hinaus wurde zur Beurteilung der In-vivo-Zytotoxizität des Virosoms eine Färbung auf Apoptose unter Verwendung des In-Situ-Cell-Death-Detection-Kits (Roche, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Kerne wurden mit 3,3-Diaminobenzidin (Sigma-Aldrich, USA) gegengefärbt. Der TUNEL-Assay wird zur Identifizierung und Quantifizierung apoptotischer Kerne durch eine In-situ-Reaktion mit TdT-vermittelter dUTP-X-Nick-End-Markierung eingesetzt. TUNEL-positive Kerne wurden mittels Lichtmikroskopie unter 400-facher Vergrößerung quantifiziert. Der Grad der TUNEL-Expression wurde in 25 verschiedenen Feldern berechnet (entsprechend einer Gesamtfläche von 0,08 mm2). Die Ergebnisse wurden in Zellen/mm2 ausgedrückt.

Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) von Mäusen wurde bei der Autopsie (Tage 36 und 255) durch eine Tracheostomie in einer Biosicherheitswerkbank gewonnen. BALF wurde durch viermaliges Spülen der Lunge mit 0,2 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) über die Trachealkanüle gesammelt. Nach der BALF-Sammlung wurde ein Proteaseinhibitor-Cocktail in einer Endkonzentration von 1x sowie Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) in einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. Ein Teil der BALF-Proben wurde für den ELISA-Test bei -80 °C gelagert. Zur Quantifizierung des gesamten IgA-Immunglobulins im BALF-Überstand wurde ein ELISA mit dem Invitrogen-Kit (Thermo Fisher, USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Ein weiterer Teil der BALF-Proben wurde zur Zellquantifizierung verwendet. Zur Zellquantifizierung wurde die Trypanblau-Ausschlussmethode unter Verwendung einer Neubauer-Kammer angewendet. Für die differenzielle zytologische Analyse wurde ein Trockenzellausstrich mit einem Aliquot der Suspension hergestellt und mit May-Grünwald-Giemsa-Färbung angefärbt. Die Objektträger wurden mittels Lichtmikroskopie analysiert. Pro Hochleistungsfeld wurden mindestens 500 Leukozyten gezählt, und die absoluten Differenzzellzahlen wurden durch Multiplikation des Prozentsatzes jedes gegebenen Zelltyps mit der Gesamtzellzahl berechnet.

Die Mäuse wurden anästhesiert und an den Tagen 0, 36 und 255 wurde über den retroorbitalen Plexus Blut gesammelt. Anschließend wurden die Seren durch einen Hämagglutinationshemmungstest (HI) auf das Vorhandensein von IAV-spezifischen Antikörpern untersucht (35). Als Antigene im HI-Assay wurden die gleichen IAV-Stämme verwendet, die in der Zusammensetzung des virosomalen Impfstoffs verwendet wurden. Die Ergebnisse wurden als geometrischer Mittelwert der Antikörpertiter angegeben.

Die komplette Milz jeder Maus wurde bei der Autopsie (Tage 36 und 255) aseptisch in RPMI 1640-Medium (Gibco) gesammelt. Jede Milz wurde mechanisch dissoziiert und durch einen Nylonfilter (70 μm) filtriert. Anschließend wurden die roten Blutkörperchen mit Pharm Lyse™-Puffer (BD Biosciences) lysiert. Die Lysereaktion wurde durch Zugabe von RPMI 1640-Medium mit 2 % FBS gestoppt und die Zellen wurden zweimal gewaschen. Die Zellen wurden in vollständigem RPMI 1640-Medium resuspendiert, ergänzt mit 10 % FBS (Gibco, Brasilien), 1 mM GlutaMAX (Gibco, Brasilien), 25 mM HEPES (Sigma-Aldrich, USA), 1 mM Natriumpyruvat (Sigma-Aldrich, USA), 50 M 2-Mercaptoethanol (Gibco, USA) und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin (Sigma-Aldrich, USA). Abschließend wurde die Zellzahl mit 0,4 % Trypanblau gezählt, um die Konzentration lebensfähiger Zellen zu bestimmen. Im Allgemeinen ergab die Milz von Mäusen etwa 8–10 × 107 lebensfähige Splenozyten. Die Zellen wurden in 95 % FBS + 5 % DMSO (Sigma-Aldrich) resuspendiert und bei einer Endkonzentration von 2 × 106 Zellen/ml kryokonserviert.

Lebensfähige Milzzellen wurden aufgetaut und in DPBS in einer Konzentration von 5 × 106 Zellen/ml suspendiert und mit 2,5 µM Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) markiert, indem das CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit (Invitrogen) gemäß früheren Berichten verwendet wurde [36]. . Nach der CFSE-Markierung wurden die Splenozyten in vollständigem RPMI 1640-Medium resuspendiert und in Platten mit 24 Vertiefungen (5 × 106 Zellen/Vertiefung) ausplattiert. Anschließend wurden die Zellen in vitro durch Zugabe von 8000 TCID50/ml der drei Impfviren (H1N1, H1N2 und H3N2) für 96 Stunden bei 37 °C, unter 5 % CO2, im Dunkeln stimuliert. Für die Negativkontrolle wurde den Zellen nur Kulturmedium zugesetzt (nicht virusstimulierte Zellen), und für die Positivkontrolle wurden die Zellen separat mit 5 µg/ml Concanavalin A aus Canavalia ensiformis (Sigma-Aldrich) stimuliert. Nach In-vitro-Stimulation von Zellen mit H1N1-, H1N2- und H3N2-Viren wurde die Lymphozytenproliferation aus der Milz 21 Tage nach der Auffrischimpfung als Indikator für T- und B-Zell-Reaktionen gemessen.

CFSE ermöglichte in Kombination mit monoklonalen Antikörpern (mAbs) den gleichzeitigen Zugriff auf die Zellproliferation und den Aktivierungsstatus von Zellsubpopulationen. Die Proliferation wurde durch den Verlust der CFSE-Fluoreszenz nachgewiesen [36]. Eine Durchflusszytometrie-Analyse wurde durchgeführt, um Lymphozyten-Subpopulationen (CD3e-, CD4-, CD8α-, CD19-, CD45R/B220- und sIgM-mAbs) zu identifizieren und zu quantifizieren, um das Ausmaß der Zellaktivierung und der Expression reifer Ruhemarker (CD23-, CD25- und CD69-mAbs) zu messen Expression von zellulären Gedächtnismarkern (CD62L- und CD44-mAbs) (Becton Dickinson; Tabelle 1). Die Zelldichten wurden berechnet und in Durchflusszytometrieröhrchen übertragen (ungefähr 1 × 106/Well). Die Zellen wurden mit einer Blockierungslösung (10 % v/v normales Mausserum) behandelt, um unbesetzte Bindungsstellen auf dem zweiten Antikörper zu blockieren, und so wurden die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem dunklen Raum mit einem Cocktail spezifischer mAbs markiert (Tabelle 1), 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) und Isotypkontrollen (BD Biosciences). Die verwendeten Antikörperkonzentrationen entsprachen den Anweisungen des Herstellers.

Vor der Probenanalyse wurden die Einstellungen des Durchflusszytometers mithilfe von Zytometer-Setup- und Tracking-Beads (CS&T-Beads, BD) überprüft, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben. Kompensationskügelchen wurden mit einzelnen Färbungen jedes Antikörpers verwendet, um die Kompensationseinstellungen festzulegen. Die Kompensationsmatrix wurde auf alle Proben identisch angewendet. Der Schwellenwert für die seitliche Streuung (SSC) wurde auf 8.000 Einheiten festgelegt, um Trümmer zu beseitigen. Die berücksichtigten Gates, die positiv und negativ färbende Zellen anzeigen, wurden basierend auf Fluoreszenz-Minus-Eins-Tests (FMO) der Proben festgelegt und diese Gates wurden konsistent auf jede Probe angewendet, was geringfügige Anpassungen für die SSC-Variabilität ermöglichte. Die Färbung mit 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) wurde verwendet, um tote von lebensfähigen Zellen mittels Durchflusszytometrie zu unterscheiden. Im vorläufigen Verfahren zur Festlegung der technischen Instrumentenparameter wurden Isotypkontrollen verwendet, um die unspezifische Fluorochromfärbung zu bewerten. Puffer für die Durchflusszytometrie wurde in PBS hergestellt, das 0,01 % w/v Natriumazid (Sigma-Aldrich), 2 % v/v FBS (Gibco) und 2 % w/v Rinderserumalbumin (BSA, Sigma-Aldrich) enthielt.

Insgesamt wurden 100.000 Ereignisse pro Röhrchen im Durchflusszytometer (Accuri C6 Plus und FACSCanto, Becton-Dickinson, USA) erfasst und mit der FlowJo-Software (Becton-Dickinson, USA) analysiert. Das Lymphozyten-Gate wurde auf Lichtstreuungseigenschaften eingestellt (Vorwärtsstreuung vs. Seitenstreuung). Die Proliferation durch CFSE (spiegelt sich in der sukzessiven Verringerung der Fluoreszenzintensitäten durch Farbstoffverteilung an Tochterzellen wider) wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der gefärbten Zellen ausgedrückt.

Unterschiede zwischen geimpften Gruppen (intranasal – IN und intramuskulär – IM-Wege) und nicht geimpften Gruppen (NV) in Bezug auf biochemische Daten, Immunglobuline, Apoptoserate und BALF-Zellzahl wurden durch ANOVA unter Verwendung des MIXED-Verfahrens des Statistical Analysis System (SAS) analysiert - Cary, North Carolina, USA). Darüber hinaus wurden Unterschiede zwischen diesen Gruppen im In-vitro-Zellproliferationstest mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests bewertet. Eine Varianzanalyse (F-Test) wurde durchgeführt, um die Auswirkung des Verabreichungswegs und des Alters im In-vitro-Zellproliferationstest zu bewerten, wobei der Tukey-Test immer dann angewendet wurde, wenn ein signifikanter Effekt (P ≤ 0,05) des Virosoms festgestellt wurde. Für die Analyse von HI wurde das beschreibende Wahrscheinlichkeitsniveau des exakten Fisher-Tests verwendet; Prozentsätze, gefolgt von unterschiedlichen Buchstaben auf den Linien, unterscheiden sich laut Fishers exaktem Test erheblich. P-Werte ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen [37].

Die vermehrten Influenzaviren wurden nach der Konzentration durch Ultrazentrifugation und der Reinigung mittels Ultrafiltration etwa 500-fach konzentriert. Tabelle 2 zeigt die Hämagglutinationstiter und den HA-Gehalt der IAVs vor der Herstellung der multivalenten Virosomen. Eine Vorformulierungsstudie wurde durchgeführt und wir fanden heraus, dass die Verwendung äquivalenter Volumina jedes Virusstamms (1:1:1) bei gekühlter Lagerung zu einer stabileren Formulierung führte.

Die gereinigten Virosomen wurden zur Elektrophorese auf ein Polyacrylamidgel geladen. Die SDS-PAGE-Analyse (semiquantitative Methode unter Verwendung von Albumin als Standard; Abb. 1) zeigte, dass die gereinigten Virosomen hauptsächlich HA enthielten, basierend auf dem erwarteten Molekulargewicht jedes IAV-Glykoproteins. Der Gesamt-HA-Gehalt der Virosomen betrug nahezu 160 µg/ml. Darüber hinaus haben wir unter Berücksichtigung des HA-Gehalts für jedes Virus geschätzt, dass der in der Formulierung angegebene Gesamt-HA-Gehalt aufgrund der Unterschiede im HA-Gehalt für jeden Stamm 6, 21 bzw. 73 % für H1N1, H1N2 und H3N2 entspricht.

SDS-PAGE-Gel und Standardkurve von Rinderserumalbumin (ca. 66,5 kDa). Wird zur Quantifizierung des Hämagglutinins der Virusstämme und multivalenten Virosomen verwendet. Auf dem SDS-PAGE-Gel ist sichtbar: HA, bestehend aus zwei Formen, ungespaltenem HA (HA0 ≈ 75–65 kDa) und gespaltenem HA (HA1 ≈ 55 kDa und HA2 ≈ 27 kDa); und NA (≈ 45–50 kDa). Die Bandenintensitäten wurden mit der ImageJ-Software erfasst

Die Virosomformulierung wurde hinsichtlich der Partikelgröße und des Zetapotentials charakterisiert, die bei etwa 110 nm (PDI = 0,19) bzw. –6,2 lagen. TEM-Bilder zeigten kreisförmige und ellipsoide Strukturen, wie in Abb. 2 dargestellt. Die Virosomen hatten einen durchschnittlichen Durchmesser von 100 nm und eine unilamellare Membran, manchmal gefolgt von Bläschen in der Nähe.

Transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Aufnahme multivalenter Virosomen, die mit den Influenzastämmen H1N1, H1N2 und H3N2 hergestellt wurden. Bild aufgenommen bei 80 kV

Um sicherzustellen, dass das Virosom aus einem nicht infektiösen Nanopartikel bestand, wurde zunächst die Infektiosität des Virosoms in embryonierten Hühnereiern und in MDCK-Zellen untersucht. In mit Virosomen inokulierten embryonierten Hühnereiern wurde keine Virusreplikation beobachtet, und im Vergleich zu Kontrollzellen gab es keine sichtbare zytopathische Wirkung auf die Zelllinie.

Die Lebensfähigkeit von RAW 264.7-Zellen wurde bewertet, nachdem die Zellen 24, 48 und 72 Stunden lang unterschiedlichen Verdünnungen von 1:2 bis 1:256 (v/v) des Virosoms ausgesetzt wurden (Tabelle 3). Nach 24 und 48 Stunden Inkubation zeigten die Zellen bei allen Virosomenverdünnungen eine Zelllebensfähigkeit von über 80 %, was auf die Sicherheit der Virosomen hinweist. Nachdem die Zellen jedoch 72 Stunden lang den Virosomenverdünnungen von 1:2 bis 1:8 ausgesetzt waren, lag die Lebensfähigkeit der Zellen zwischen 75 und 80 %, was zeigt, dass die Langzeitexposition leicht zytotoxisch war. Außerdem zeigte die Exposition gegenüber den anderen bewerteten Virosomverdünnungen im Vergleich zur Negativkontrolle im MTT-Assay in diesem Inkubationsintervall keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen (> 80 %). Im Allgemeinen wurde die Virosomformulierung bei Verdünnungen von 1:16 bis 1:256 bei allen Expositionszeiten gut vertragen. In Bezug auf die Zellapoptose lag die mittels Durchflusszytometrie bestimmte Zytotoxizitätsrate (apoptotische Zellen) für beide ausgewerteten Virosomverdünnungen (1:32 und 1:64) im gleichen Zeitraum (24, 48 und 72 Stunden) zwischen 1 und 2 %. [38].

Unabhängig vom Verabreichungsweg des virosomalen Impfstoffs wurden zwischen nicht geimpften und geimpften Mäusen keine signifikanten Verletzungszeichen oder Unterschiede festgestellt (Tabelle S1, Zusatzdatei 1). Die hepatischen (AST und ALT) und renalen (Harnstoff und Kreatinin) Werte lagen im Normbereich [39]. Darüber hinaus zeigten Mäuse keine Nebenwirkungen im Zusammenhang mit der Immunisierung mit den Virosomen.

Was die histopathologische Analyse angeht, zeigten die verschiedenen untersuchten Gewebe (Niere, Lunge und Leber) keine relevanten mikroskopischen Veränderungen. Darüber hinaus zeigte der TUNEL-Assay keinen Unterschied in der Rate der zellulären Apoptose in Niere und Leber von mit dem Virosom immunisierten Tieren, die nach 36 Tagen mit der Kontrollgruppe vergleichbar war (Abbildung S1, Zusatzdatei 2).

Im Durchschnitt betrug das zurückgewonnene BALF-Volumen 82 %. Die Mittelwerte für die Gesamtzellzahl von BALF nach 36 Tagen bei Mäusen in der intranasal geimpften, intramuskulär geimpften und nicht geimpften Gruppe betrugen 8,8 ± 1,2 × 105 Zellen/ml, 7,65 ± 0,9 × 105 Zellen/ml und 5,7 ± 0,7 × 105 Zellen/ml. In allen Gruppen bestand die zelluläre Zusammensetzung von BALF überwiegend aus Alveolarmakrophagen (> 53 %) und einer geringeren Anzahl von Lymphozyten (< 43 %) und Neutrophilen (< 1 %). Beide Gruppen immunisierter Mäuse (intranasal und intramuskulär) zeigten im Vergleich zu den nicht immunisierten Tieren einen Anstieg der Lymphozytenpopulation (P ≤ 0,0001) (Tabelle 4). Bei intranasal immunisierten Mäusen kam es auch zu einem stärkeren Anstieg der Gesamtzellpopulation.

Die Titer der Hämagglutinationshemmung (HI) für die drei IAV-Subtypen (H1N1, H1N2 und H3N2) wurden in Serumproben gemessen, die an den Tagen 21 (Tag 36) und 240 (Tag 255) nach der Auffrischungsimpfung sowohl für die intramuskuläre als auch für die intranasale Immunisierung entnommen wurden. Die Seren von Mäusen, die auf intramuskulärem Weg mit Virosomen immunisiert wurden, zeigten bei den drei Impfstämmen einen signifikant stärkeren Anstieg der HI-Titer als die intranasale Immunisierung (P ≤ 0,0001; Abb. 3). In den Nachuntersuchungen (Tage 36) hatten alle Mäuse in der intramuskulär geimpften Gruppe impfstoffinduzierte HI-Antikörpertiter (˃1:40) gegen H3N2. Die schwachen Reaktionen auf H1N1- und H1N2-Antikörpertiter (˂1:40) wurden bei einigen intramuskulär immunisierten Mäusen festgestellt. Dennoch war der intramuskuläre Impfstoff bei Mäusen immunogen und löste signifikante HI-Antikörperreaktionen gegen H1N1, H1N2 und H3N2 aus. Die Serokonversion zur intramuskulären Immunisierung 21 Tage nach der Auffrischimpfung betrug 90 % H1N1, 80 % H1N2, 100 % H3N2.

Hämagglutinationshemmungstest (HI). (NV) nicht geimpft, (IM) intramuskulär geimpft und (IN) intranasal geimpft. Antikörpertiter mittels HI-Test für die Subtypen H1N1, H1N2 und H3N2 in Serumproben von Mäusen am 21. und 240. Tag nach der Impfung. Die Daten werden für jede Maus pro Gruppe angezeigt und die schwarzen Linien stellen die geometrischen Mitteltiter ± Standardabweichung dar

Intranasal geimpfte Mäuse hingegen entwickelten 21 Tage nach der Auffrischimpfung (Tag 36) keine nachweisbaren HI-Antikörpertiter. Nur eine intranasal geimpfte Maus wies 8 Monate nach der zweiten Immunisierung HI-Antikörper gegen die Viren H1N1 (Titer 1:40), H1N2 (1:40) und H3N2 (1:40) auf, wie in Abb. 3 dargestellt. Die intramuskuläre Immunisierung löste sie aus eine höhere Serokonversionsrate (90 % H1N1, 40 % H1N2, 100 % H3N2) im Vergleich zur intranasalen Immunisierung (10 % H1N1, 10 % H1N2, 10 % H3N2) 8 Monate nach der Auffrischimpfung.

Das gesamte Immunglobulin-IgA wurde im BALF von Mäusen quantifiziert. ELISA-Tests für Gesamtantikörper ergaben, dass geimpfte Mäuse unabhängig vom Verabreichungsweg am 21. Tag nach der Impfung eine höhere IgA-Konzentration aufwiesen als nicht geimpfte Mäuse (6,85 ± 0,98 mg/dl) (P ≤ 0,0001). Tiere, die intranasal mit dem Virosom geimpft wurden (57,84 ± 3,61 mg/dl), hatten höhere IgA-Konzentrationen als intramuskulär geimpfte Mäuse (36,81 ± 5,39 mg/dl, P ≤ 0,0001; Abb. 4).

Quantifizierung des gesamten IgA-Antikörpers in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) von Mäusen mittels ELISA-Assay. Die Daten werden für jede Maus pro Gruppe angezeigt und die schwarzen Linien stellen den Mittelwert ± Standardfehler dar. NV = nicht geimpft; IM = intramuskulär geimpft; IN = intranasal geimpft

Um zu untersuchen, ob das Virosom eine zellvermittelte Immunität induziert, wurden an den Tagen 21 und 240 nach der zweiten Impfung T-Zellsuspensionen von geimpften Mäusen gewonnen. Die Tore wurden unter Verwendung der nicht virusstimulierten Probe für jede einzelne Maus festgelegt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Gate auf Vorwärtsstreuungs- (FSC) und Seitenstreuungsmerkmalen (SSC) basierte, um die Lymphozytenpopulation abzuschätzen und Ablagerungen auszuschließen. Die Dublettzellen wurden einem Dublettdiagramm unterzogen, das die Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H) gegen die Vorwärtsstreufläche (FSC-A) zeigt. Abgestorbene Zellen wurden mittels 7-AAD-Färbung von der Analyse ausgeschlossen. Die Proliferation von Lymphozyten wurde mit CFSElow bestimmt, was die Bewertung der spezifischen Proliferation ermöglichte, die in jeder Versuchsgruppe durch jedes Virus (H1N1, H1N2 und H3N2) induziert wurde. Durch Gegenfärbung mit CD3e und CD45R/B220 konnten wir T- bzw. B-Zellen ansteuern. Unter den T-Lymphozyten (CD3e+) wurden Untergruppen von CD4+ T-Zellen, CD8α+ T-Zellen, CD62L, CD44, CD25 und CD69 anhand von Panels unterschieden. In der ersten Analyse wurden Gates in den CD4+- und CD8+-Populationen für die Analyse von T-Lymphozyten-Untergruppen verwendet. In der zweiten Analyse wurden Gates in den Populationen CD69+ und CD69+CD25+ verwendet, und in der dritten Analyse wurden Gates in den Populationen CD3e+CD4+CD44highCD62Lhigh und CD3e+CD4+CD44highCD62Llow verwendet. Unter den B-Lymphozyten-Zellen wurden aktivierte Lymphoblasten mit einem Maus-B-Lymphozyten-Aktivierungs-Antikörpercocktail und einem Maus-B-Lymphozyten-Untergruppen-Antikörpercocktail gefärbt.

Der In-vitro-Test zur stimulierten Lymphozytenproliferation identifizierte zehn verschiedene Zelluntergruppen: CD3e+CD4+ (CD4+ T-Lymphozyten), CD3e+CD8α+ (CD8+ T-Lymphozyten), CD3e+CD69+ (sehr früh aktivierte T-Zellen), CD3e+CD69+CD25+ ( Effektor-T-Zellen), CD3e+CD4+CD44highCD62Lhigh (zentrales Gedächtnis CD4+ T-Lymphozyten), CD3e+CD4+CD44highCD62Llow (Effektor-Gedächtnis CD4+ T-Lymphozyten), CD19+CD69+ (sehr früh aktivierende B-Zelle), CD19+CD69+CD25+ (Effektor). B-Zellen), CD45R/B220+sIgM+ (unreife und reife B-Zellen oder Übergangs-B-Zellen) und CD45R/B220+sIgM+CD23+ (reife ruhende konventionelle B-Zellen).

Insbesondere führten intramuskuläre und intranasale Immunisierungen zu einer robusten T-Zell- und B-Zell-Antwort (Abb. 5). Bei H1N1-, H1N2- und H3N2-Viren wiesen mit Virosomen geimpfte (intramuskuläre und intranasale Immunisierung) Mäuse mehr als zweifach höhere Werte an T-Zell-Untergruppen auf als nicht geimpfte oder naive Mäuse (Abb. 5). Sowohl die intramuskuläre als auch die intranasale Immunisierung führten zu höheren CD3e+CD4+-, CD3e+CD8α+-, CD3e+CD69+-, CD3e+CD69+CD25+-, CD3e+CD4+CD44highCD62Lhigh- und CD3e+CD4+CD44highCD62Llow-T-Zell-Untergruppen für H1N1 (P ≤ 0,0001). H1N2 (P ≤ 0,001) und H3N2 (P ≤ 0,001) (Abb. 5 und Tabelle S2, Zusatzdatei 1). Der Verabreichungsweg beeinflusste die Menge einiger Zelluntergruppen, wobei die intranasale Immunisierung mehr CD3e+CD69+-Zellen produzierte (P ≤ 0,05) und die intramuskuläre Verabreichung mehr CD3e+CD69+CD25+-Zellen produzierte (P ≤ 0,05; Tabelle 5).

In-vitro-Zellproliferationstest. Immunzellen im Splenozyten-Proliferationstest, die mit den Impfviren (H1N1, H1N2 und H3N2) stimuliert wurden, wurden als fache Veränderung der intranasal (IN) und intramuskulär (IM) geimpften Gruppe gegenüber der nicht geimpften Gruppe (NV) am 21. Tag verglichen nach der Impfung. Die gezeigten Daten sind der fache Anstieg des mittleren Prozentsatzes und des Standardfehlers der angegebenen Immunzellen von geimpften Mäusen im Vergleich zu denen von nicht geimpften (NV) Mäusen. ¥P ≤ 0,05 gegenüber NV, £P ≤ 0,005 gegenüber NV, #P ≤ 0,001 gegenüber NV, φP ≤ 0,0005 gegenüber NV und *P ≤ 0,0001 gegenüber NV.

Mit Virosomen (intramuskulär und intranasal) immunisierte Mäuse zeigten 21 Tage nach der Impfung (Tag 36) einen signifikanten Anstieg der absoluten Anzahl von Effektor- (CD19+CD69+ und CD19+CD69+CD25+), Übergangs- und reifen B-Zellen (CD45R/ B220+sIgM+) im Vergleich zum Ausgangswert (P ≤ 0,05) für H1N1, H1N2 und H3N2 (Abb. 5; Tabelle 5). Im Gegensatz dazu begünstigte die intranasale Immunisierung eine stärkere Etablierung von B-Zellen, CD45R/B220+sIgM+, CD19+CD69+ und CD19+CD69+CD25+ Zelluntergruppen für H1N1, H1N2 und H3N2 als die intramuskuläre Immunisierung (Tabelle 5).

Eines der Ziele der Impfung ist die Schaffung einer langanhaltenden schützenden Immunität. Daher untersuchten wir die Langlebigkeit der durch die Virosomenimpfung ausgelösten H1N1-, H1N2- und H3N2-Antikörperreaktionen. Die H1N1-, H1N2- und H3N2-spezifischen HI-Antikörperreaktionen bei mit Virosomen immunisierten Mäusen blieben über 8 Monate lang auf einem deutlich höheren Niveau (Abb. 5) als bei nicht geimpften Mäusen, was darauf hindeutet, dass die Influenzavirus-Immunität von langer Dauer sein kann.

Um die langfristige Schutzwirkung zu beurteilen, wurden zelluläre Immunantworten auch in Mäusegruppen analysiert, die 8 Monate nach der Impfung intramuskulär und intranasal mit multivalenten Virosomen immunisiert wurden.

Wie in Tabelle 5 (Vergleich zwischen den Verabreichungswegen) und Tabelle S2, Zusatzdatei 1 (Vergleich zwischen nicht geimpfter und intramuskulär geimpfter Gruppe und nicht geimpfter und intranasal geimpfter Gruppe) gezeigt, zeigten immunisierte Mäuse 8 Monate nach der Auffrischimpfung einen Weg -abhängiger Anstieg von CD45R/B220+sIgM+CD23+ im Vergleich zur nicht geimpften Gruppe (P ≤ 0,0001). Im Vergleich zu nicht geimpften Mäusen zeigten intramuskulär und intranasal immunisierte Mäuse eine signifikante T- und B-Zell-Proliferation als Reaktion auf H1N1, H1N2 und H3N2 (P ≤ 0,05; Tabelle S2, Zusatzdatei 1). Allerdings zeigten intranasal immunisierte Mäuse ein höheres Maß an Proliferation der T-Zell-Untergruppe (CD3e+CD69+; Tabelle 5) als intramuskulär immunisierte Mäuse. Die CD3e+CD4+CD44high-CD62Lhigh- und CD3e+CD4+CD44high-CD62Llow-Zelluntergruppen für H1N1, H1N2 und H3N2 waren bei intramuskulärer Immunisierung signifikant höher als bei intranasaler Immunisierung (P ≤ 0,05), ebenso wie die CD3e+CD69+CD25+- und Zelluntergruppen für H1N1 (Tabelle 5). Intramuskuläre Immunisierungen führten zu stärkeren gedächtnisbezogenen zentralen Reaktionen in anderen Geweben als der Atemschleimhaut, beispielsweise der Milz.

Die Entwicklung neuartiger Impfstoffkandidaten, die die native Morphologie des spezifischen Virus genau nachahmen, ohne selbst pathogen zu sein, bleibt eine große Herausforderung bei der Entwicklung von Grippeimpfstoffen [40]. Virosomen sind streng kontrollierte virusähnliche Partikel, die in der Impfstoffformulierung verwendet werden können [41]. Im Allgemeinen bieten Impfungen oder Infektionen aufgrund des Auftretens neuer oder antigenisch unterschiedlicher Influenza-A-Virusstämme keinen dauerhaften Schutz [4]. Daher ist die Entwicklung neuer, hochwirksamer und gut verträglicher Impfstoffe unerlässlich. In einer Studie zur Sicherheit und Immunogenität am Menschen wurde ein Prototyp eines trivalenten Virosom-Influenza-Impfstoffs mit kommerziellen Impfstoffen gegen inaktivierte Viren und Untereinheiten verglichen [42]. Der Virosom-Impfstoff erzeugte höhere Schutztiter und war weniger reaktogen und immunogener als die Impfstoffe gegen das gesamte inaktivierte Virus oder Untereinheiten-Influenza. Die Synthese von Liposomen unter Verwendung von Hüllen des Influenza-A-Virus (Virosom), die die wichtigsten viralen Antigene (HA und NA) enthalten, hat zu ermutigenden Ergebnissen geführt [4, 27]. In der aktuellen Untersuchung haben wir ein multivalentes Virosom aus einem Cocktail von Oberflächenglykoproteinen der Viren H1N1, H1N2 und H3N2 mithilfe der Rekonstitutionstechnik mit DCPC als Detergens entworfen und seine Immunogenität als swIAV-Impfstoffkandidat an Mäusen untersucht. de Jonge, Holtrop [43] zeigten, dass die Verwendung von DCPC als Lösungsvermittler für virale Membranen erhebliche Vorteile gegenüber dem herkömmlichen Ansatz der Virosomsynthese hat, bei dem die Virushülle mit Triton X-100 solubilisiert und anschließend mit Polystyrolkügelchen entfernt wird . Angesichts der hohen kritischen Mizellenkonzentration von DCPC ist die Dialyse ein effizientes Verfahren zur Entfernung von DCPC. Sie ermöglicht die Selbstorganisation von Virosomvesikeln mit dem Vorteil, dass die viralen Antigene (HA und NA) nicht verändert werden, ein häufiges Problem im Zusammenhang mit Triton X -100 (Änderung der Proteinkonformation und Verlust der Antigenität) [44, 45].

Die SDS-PAGE-Analyse ergab, dass multivalente Virosomen sowohl HA- als auch NA-Proteinbanden enthielten und keine Virus-Nukleokapsidkomplexe enthielten. Der durchschnittliche Durchmesser der Virosomen betrug etwa 110 nm, was mit den Beobachtungen in früheren Experimenten übereinstimmt [46]. Was die Bestätigung von HA (und in geringerem Maße NA) durch Elektrophorese betrifft, kann dies zur Präsentation zusätzlicher Antigene durch Proteine ​​des Haupthistokompatibilitätskomplexes der Klassen I und II (MHC-I und MHC-II) führen, was zur Aktivierung von T führt - und B-Zellen und dendritische Zellen, wie sie bei einer Virusinfektion auftreten [47, 48]. Darüber hinaus sind Influenza-Virosomen eine vielversprechende Strategie zur Antigen-Dosiseinsparung, da sie bei niedrigen Dosen zu einer hohen Immunantwort führen, ohne die Schutzwirkung des Impfstoffs zu beeinträchtigen [49]. Wir haben gezeigt, dass die swIAV-Virosomen stark immunogen sind und eine starke humorale und zelluläre Immunantwort gegen H1N1-, H1N2- und H3N2-Viren hervorrufen können.

Die Bewertung der In-vitro-Sicherheit von Virosom ist von entscheidender Bedeutung, um es vor seiner Verabreichung an Tiere als neuen Impfstoffprototyp zu betrachten [48]. Um sicherzustellen, dass das Virosom nicht infektiös ist, wurde die Nanoformulierung in embryonierte Hühnereier geimpft. Dabei zeigte sich, dass kein lebensfähiges Virus vorhanden war, jedoch eine HA-Agglutinationsaktivität vorhanden war, was darauf hindeutet, dass die Virusschädigung und die Rekonstitution des Virosoms erfolgreich waren. Darüber hinaus wurden Zelllebensfähigkeitstests durchgeführt, die ergaben, dass in keiner der bewerteten Virosomverdünnungen signifikante Veränderungen festgestellt wurden. Dieses Ergebnis diente als Bestätigung ihrer Sicherheit für In-vivo-Experimente.

Die zytologische Untersuchung von BALF ergab, dass die Infiltration von Lymphozytenzellen in die Atemwege bei den geimpften Mäusen im Vergleich zu den nicht geimpften Mäusen deutlich höher war. In früheren Studien deutete diese Lymphozyteninfiltration in BALF darauf hin, dass die durch die Impfung verursachte zelluläre Immunantwort mit den in der Lunge beobachteten entzündlichen Zellreaktionen zusammenhängen könnte [50]. Eine Infiltration von Lymphozyten in die Bronchien und Alveolen sowie eine lymphatische Hyperplasie um die Bronchien und Blutgefäße wurden jedoch weder in der geimpften noch in der nicht geimpften Gruppe beobachtet. Darüber hinaus wurde in der Lunge geimpfter Mäuse keine Veränderung der zellulären Apoptoserate beobachtet.

In der Literatur fehlen etablierte operative Definitionen für das Nachlassen der Influenza-Immunität; Daher wurde die Immunogenität in dieser Studie anhand der Kriterien der Europäischen Agentur für die Bewertung von Arzneimitteln (EMEA) bewertet [51]. Gegen das HA-Protein gerichtete Antikörper, die durch einen Hämagglutinationshemmungstest (HI) gemessen werden, korrelieren mit dem Schutz vor Influenza [3]. Im Mausmodell haben bereits geringe Werte einer bereits bestehenden Influenza-Immunität (immunologisches Gedächtnis) eine immunstimulierende Wirkung, da sie die Antikörperantwort gegen nicht verwandte Antigene verstärken, die von Influenza-Virosomen abgegeben werden [48]. Um die schützende Immunogenität zu bestätigen, sollte daher mindestens eine der drei EMEA-Anforderungen erfüllt sein: (i) Serokonversion, definiert durch einen ˃4-fachen Anstieg des HI-Antikörpertiters bis zum Erreichen eines HI-Titers von ≥ 1:40, in ˃40 % der Fälle immunisierte Probanden; (ii) ein Anstieg der geometrischen Mitteltiter (GMT) um das 2,5-fache; und (iii) Seroprotektion, definiert durch das Erreichen eines HI-Titers von ≥ 1:40 bei ˃70 % der Probanden. Liposomen, die keine Influenzavirus-Proteine ​​enthielten, wurden einer zusätzlichen Kontrollgruppe verabreicht (Daten nicht gezeigt). Diese Gruppe zeigte ähnliche HI-Antikörper-Ergebnisse wie die nicht geimpfte Gruppe. Ein wichtiges Ergebnis war, dass das polyvalente Influenza-basierte Virosom schützende HI-Titer gegen die drei IAV-Stämme erzeugte, die bei den intramuskulär immunisierten Mäusen im Vergleich zu den intranasal immunisierten Mäusen signifikant höher waren. Gemäß den EMEA-Kriterien wurden Serokonversion und Seroprotektion für drei IAV-Stämme durch intramuskuläre Verabreichung von Virosomen erreicht. Angesichts der Tatsache, dass die verwendeten Mäuse spezifisch pathogenfrei und isogen waren, auch ohne die Bewertung von Antikörpern vor der Immunisierung, wurde die fache Veränderung mit den Antikörpertitern nicht geimpfter Mäuse verglichen, die als Ausgangswerte galten. Andererseits hatten intranasal immunisierte Mäuse zu Studienbeginn nicht schützende Antikörpertiter, die denen früherer Studien ähnelten [52]. Nur eines der intranasal geimpften Tiere zeigte acht Monate nach der Impfung HI-Antikörper. Um eine qualitativ hochwertige mukosale Impfstoffreaktion gegen IAV zu erhalten, ist es laut diesem Tier notwendig, die Formulierung neu zu bewerten und neue Strategien zur Auslösung systemischer und mukosaler Immunreaktionen in Betracht zu ziehen, einschließlich der Verwendung geeigneter Impfstoffadjuvantien. Mit ziemlicher Sicherheit stiegen die Antikörperspiegel langsamer an, der Höhepunkt nach der Impfung lag später und wurde in der ersten Analyse nicht festgestellt. Unsere Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass eine nasal verabreichte Immunisierung mit multivalenten swIAV-Virosomen lokale Immunantworten hervorrufen kann, die eine stärkere Produktion von IgA in BALF stimulieren, was zum Schutz von Mäusen vor einer nachfolgenden Belastung beitragen kann. Daher induzierte die intranasale Immunisierung mit dem virosombasierten swIAV keine systemische humorale Immunantwort, konnte jedoch eine lokale humorale Immunantwort induzieren. Darüber hinaus heben wir hervor, dass die intranasale Formulierung aus einem einfachen mukoadhäsiven System (Einschluss von Carboxymethylcellulose) bestand und dass die immunologischen Ergebnisse möglicherweise durch die Entwicklung eines ausgefeilteren intranasalen Verabreichungssystems verbessert werden könnten.

Die Lymphozytenproliferation aus der Milz ist in der geimpften Gruppe deutlich höher als in der nicht geimpften Gruppe. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der multivalente virosomale swIAV-Impfstoff in der Lage war, Effektor-, Übergangs- und reife B-Zellen sowie Gedächtnis- und Effektor-T-Zellen mit erhöhter Proliferation nach Virusstimulation zu induzieren. Nanopartikel und möglicherweise Virosomen verkapseln häufig Ligandenmoleküle für Mustererkennungsrezeptoren (PRRs; z. B. Toll-like-Rezeptoren, TLRs), die in dendritischen Zellen und B-Zellen exprimiert werden [53, 54]. Exprimierte Virosomen enthalten manchmal virale DNA oder RNA, die das Potenzial hat, DNA- oder RNA-Sensoren (z. B. TLR9 und TRL7) in B-Zellen und dendritischen Zellen zu aktivieren [55]. Daher spekulieren wir, dass TLR-Signale bei der Auffrischimpfung von Gedächtnis-B-Zellen in unserem experimentellen System eine antikörperverstärkende Rolle spielen könnten. Darüber hinaus können Nanoimpfstoffe direkt auf P-bindende Gedächtnis-B-Zellen wirken; Aufgrund der starken BCR-Vernetzung erhalten sie schließlich robuste B-Zell-Rezeptor (BCR)-Signale oder eine erhöhte T-Zell-Hilfe [54]. Die Stimulation von Splenozyten geimpfter Mäuse mit H1N1-, H1N2- und H3N2-Viren löste unter diesen Bedingungen auch eine höhere Zellproliferation von Effektor-, Übergangs- und reifen B-Zellen aus.

Es ist bekannt, dass T-Zell-Reaktionen zur Ausweitung der Kreuzschutzimmunität beitragen [56]. Die Zellproliferationsreaktion der Liposomen-Kontrollgruppe (Daten nicht gezeigt) war dieselbe wie die der nicht geimpften Gruppe. Unsere Ergebnisse zeigten bei geimpften Mäusen einen höheren Anteil an CD3e+CD4+ T-Helferzellen, CD3e+CD8a+ T-Zytotoxikzellen und CD3e+CD69+CD25+ T-Effektorzellen. Die multivalenten swIAV-Virosomen lösten eine robuste zytotoxische T-Lymphozyten (CTL)-Reaktion aus, die durch CD8+ T-Lymphozyten vermittelt wird und für die Virus-Clearance wichtig ist [57]. Die Induktion einer T-Helfer-Antwort ist für die Unterstützung der antigenspezifischen B-Zell- und/oder zytotoxischen T-Lymphozyten-Antwort erforderlich [48]. Bemerkenswert ist, dass die intranasale und intramuskuläre Immunisierung mit einer stärkeren Aufnahme von CD69 verbunden war, einem Aufenthaltsmarker, der mit der Retention in lymphatischen Geweben verbunden ist [58].

Die in dieser Studie beobachteten Hinweise deuten darauf hin, dass die Immunisierung mit dem Virosom CD4+-T-Zellen im zentralen Gedächtnis und im Effektorgedächtnis induzierte. Diese kurz- und langfristigen Gedächtnisuntergruppen entstehen nach Antigenstimulation mit erhöhten Proliferations- und Rekonstitutionskapazitäten bei immunisierten Mäusen. Impfinduzierte Gedächtnis-T-Zellen können entscheidend für die Erzeugung einer lang anhaltenden Immunität und die Einleitung der Viruszerstörung sein. Wir beobachteten, dass Effektorzellen und CD4+-T-Zellen im zentralen Gedächtnis 21 Tage nach der Auffrischimpfung reichlich vorhanden waren, mit der Zeit jedoch abnahmen, obwohl sie im Vergleich zu nicht geimpften Mäusen immer noch höher waren. Somit haben CD4+-T-Zellen im zentralen Gedächtnis, die durch Virosom-Immunisierung induziert werden, eine lange Lebensdauer und können CD8+-T-Zellen möglicherweise nachhaltig helfen [59]. Die langlebige Gedächtnis-T-Zellpopulation verfügt über eine erhöhte Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Multipotenz, um das gesamte Gedächtnis (zentrales Gedächtnis und Effektorgedächtnis) und Effektor-T-Zell-Untergruppen in vitro zu erzeugen [60]. Mäuse wurden zweimal geimpft, was ausreichte, um eine H1N1-, H1N2- und H3N2-IAV-spezifische Gedächtnis-T-Zellantwort hervorzurufen, wodurch die Notwendigkeit heterologer Prime-Boost-Ansätze entfällt. Daher führt die Vermeidung einer kontinuierlichen Antigenstimulation, die als unerwünschte Konsequenz zu einem fortschreitenden Verlust des Gedächtnispotentials führen kann, dazu, dass T-Zellen in Richtung terminaler Differenzierung getrieben werden, was ihre Fähigkeit, systemische Infektionen zu beseitigen, beeinträchtigt [61, 62]. Das signifikante Vorhandensein von Gedächtniszellen nach der Impfung und ihre erhöhte Proliferationskapazität können die Bildung aller Untergruppen von Effektor- und Gedächtnis-T-Zellen aufrechterhalten.

Diese Ergebnisse zusammen haben erhebliche Auswirkungen auf die Entwicklung von T-Zell-basierten Impfstoffen, die gegen intrazelluläre Krankheitserreger wie das Influenzavirus gerichtet sind [60]. Darüber hinaus vermuten wir, dass die hier beobachteten Immunitätswerte geringer sind als die beschriebene Immunität, die durch eine virale Belastung nachgewiesen wurde. HI wird als Parameter zur Definition des durch eine Impfung hervorgerufenen Schutzes allgemein akzeptiert. Darüber hinaus quantifiziert HI die Antikörperreaktion auf den kugelförmigen Kopf des Influenza-Hämagglutinins, bewertet jedoch nicht die Fähigkeit der Antikörper, eine Virusinfektion zu neutralisieren [63, 64]. Dennoch besteht eine starke Korrelation zwischen HI und funktionellen virusneutralisierenden Antikörpern [63]. Selbst wenn schließlich bei > 70 % der isogenen Mäuse, die intramuskulär gegen die Subtypen H1N1, H1N2 und H3N2 geimpft wurden, eine Seroprotektion erreicht wird, sind zukünftige Seroprotektionsstudien an der Zielart (Schweine) von entscheidender Bedeutung. Die Antikörpertiter können vor und nach der Impfung aufgrund verschiedener Umstände schwanken, darunter frühere Influenza-Infektionen und Impfungen, genetische Variationen und frühere heterologe Infektionen [63], aber unsere Mäuse hatten vor der ersten Immunisierung keine Antikörpertiter. Den erhaltenen Ergebnissen zufolge war das entwickelte multivalente swIAV-Virosom bei intramuskulärer Verabreichung bei Mäusen immunogen, induzierte systemische Antikörper und bot das Potenzial, vor einer Influenza-Infektion zu schützen.

Die Daten, die diese Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

7-Aminoactinomycin D

Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit

B-Zell-Rezeptor

Rinderserumalbumin

Carboxyfluoresceinsuccinimidylester

Carboxymethylcellulose

Einrichtung und Verfolgung des Zytometers

Zytotoxischer T-Lymphozyten

1,2-Dicaproyl-sn-glycero-3-phosphocholin

Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium

Dimethylsulfoxid

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung von Dulbecco

Europäische Arzneimittelbewertungsagentur

Fetales Kälberserum

Fluoreszenz minus eins

Vorwärtsstreuung

Vorwärtsstreubereich

Streuhöhe nach vorne

Geometrische Mitteltiter

Hämagglutinin

Hämatoxylin und Eosin

Hemmung der Hämagglutination

H1N1-Pandemie

Influenza-A-Virus

Intramuskulär

Intranasal

Monoklonale Antikörper

Madin-Darby-Hundeniere

Großer Histokompatibilitätskomplex

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

Neuraminidase

Nicht geimpft

Optische Dichten

Polyethersulfon

Propidiumiodid

Phenylmethylsulfonylfluorid

Mustererkennungsrezeptor

Statistisches Analysesystem

Spezifisch frei von Krankheitserregern

Seitliche Streuung

Schweinegrippe-A-Virus

Terminale Desoxynukleotidyltransferase

Transmissionselektronenmikroskopie

Tollartiger Rezeptor

Tris-NaCl-EDTA

Virusähnliches Partikel

Ganzes inaktiviertes Virus

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Die Autoren danken Arlei Coldebella für die statistische Analyse. VH hat einen Zuschuss von der Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES), Finanzcode 001.

Diese Arbeit wurde von der brasilianischen Agrarforschungsgesellschaft (Embrapa, 12.13.10.004.00.00) und der Stiftung zur Unterstützung von Forschung und Innovation des Staates Santa Catarina (FAPESC, Projektzugangsnummer 2017TR1738) unterstützt. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerhebung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.

Embrapa Schweine und Geflügel, Concórdia, SC, Brasilien

Francisco Noé Fonseca, Danielle Gava, Rejane Schaefer und Ana Paula Bastos

Bundesuniversität Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasilien

Vanessa Hague und Lana Flavia Baron

Instituto Federal Catarinense – Campus Concórdia, Concórdia, SC, Brasilien

Franciana Volpato Bellaver & Gabrielly Bombassaro

Embrapa Genetic Resources, Brasília, DF, Brasilien

Luciano Paulino da Silva

Universität Brasília, Brasília, DF, Brasilien

Mayara Simonelly

Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora-MG, Juiz de Fora, MG, Brasilien

Wanessa Araújo Carvalho

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Konzeption und Design der Studie, FNF und APB; führte das Experiment durch: FNF, VH, FVB, GB, DG, LSP, LFB, MS und APB; Datenanalyse und Kuration, FNF, VH, FVB, DG, WCA, RS und APB; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, FNF und APB; Schreiben – Rezension und Bearbeitung, FNF, VH, DG, WCA, RS und APB; Finanzierungsakquise, APB; Betreuung der Forschung, RS und APB. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Ana Paula Bastos.

Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die den Anschein erwecken könnten, dass sie die in diesem Artikel beschriebene Arbeit beeinflusst hätten.

Alle Versuchs- und Tiermanagementverfahren wurden vom Animal Use Ethics Committee von Embrapa Swine and Poultry genehmigt (Protokollnummer 001/2016).

Unzutreffend.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Fonseca, FN, Haach, V., Bellaver, FV et al. Immunologisches Profil von Mäusen, die mit einem polyvalenten Influenza-Impfstoff auf Virosombasis immunisiert wurden. Virol J 20, 187 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02158-0

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Eingegangen: 24. Mai 2023

Angenommen: 11. August 2023

Veröffentlicht: 21. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02158-0

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