Bakterielles PncA verbessert die Ernährung

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 235 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+) ist entscheidend für den Energiestoffwechsel, oxidativen Stress, die Reparatur von DNA-Schäden, die Regulierung der Langlebigkeit und verschiedene Signalprozesse. Bisher wurden mehrere NAD+-Synthesewege in Mikrobiota und Säugetieren gefunden, aber die mögliche Beziehung zwischen Darmmikrobiota und ihren Wirten bei der Regulierung der NAD+-Homöostase bleibt weitgehend unbekannt. Hier haben wir gezeigt, dass ein Analogon des First-Line-Tuberkulose-Medikaments Pyrazinamid, das durch Nicotinamidase/Pyrazinamidase (PncA) in seine aktive Form umgewandelt wird, den NAD+-Spiegel im Darm und in der Leber von Mäusen beeinflusst und die Homöostase der Darmmikrobiota stört. Darüber hinaus wurden durch die Überexpression von modifiziertem PncA von Escherichia coli die NAD+-Spiegel in der Mausleber signifikant erhöht und die ernährungsbedingte nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) bei Mäusen gelindert. Insgesamt spielt das PncA-Gen in der Mikrobiota eine wichtige Rolle bei der Regulierung der NAD+-Synthese im Wirt und stellt somit ein potenzielles Ziel für die Modulation des NAD+-Spiegels im Wirt dar.

Bereits vor 110 Jahren wurde NAD+ von den britischen Biochemikern Arthur Harden und William John Young als Coenzym entdeckt, das an der hefevermittelten Alkoholgärung beteiligt ist1. Im Laufe der nächsten ca. 30 Jahre wurde die chemische Zusammensetzung dieses Coenzyms bestimmt und es wurde festgestellt, dass es zusammen mit NADH an mehreren Redoxreaktionen teilnimmt. Obwohl die Rolle von NAD+ bei Oxidations-Reduktions-Reaktionen gut verstanden ist, wurde die Funktion von NAD+ erst in den letzten 10 Jahren vollständig aufgeklärt. Die Sirtuin-Familie (SIRT), Poly-(ADP-Ribose)-Polymerasen (PARPs) und zyklische ADP-Ribose-Synthasen (cADPRSs) sind NAD+-abhängige Enzyme; NAD+ reguliert also nachgeschaltete Stoffwechselwege, indem es die Aktivität dieser Enzyme beeinflusst und als Stoffwechselsensor in Zellen fungiert2,3,4,5. Darüber hinaus spielen diese NAD+-abhängigen Proteine eine wichtige Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen wie Stoffwechsel, Signaltransduktion, oxidativem Stress, kognitivem Verfall und anderen altersbedingten physiologischen Prozessen. In den letzten Jahren haben wichtige Studien gezeigt, dass NAD+ an das 5′-Ende der mRNA bindet und dadurch die Transkriptionsinitiierung von Genen reguliert. Es gibt jedoch noch keine endgültige Schlussfolgerung darüber, wie dieser Prozess reguliert wird und welche Bedeutung er für Organismen hat6,7.

NAD+ ist ein kleines Molekül, das von fast allen Organismen benötigt wird und eines der am häufigsten vorkommenden Moleküle im menschlichen Körper ist, das an mehr als 500 verschiedenen enzymatischen Reaktionen beteiligt ist8. Bei Säugetieren gibt es drei Hauptsynthesewege für NAD+: den De-novo-Syntheseweg unter Verwendung von Tryptophan, den Salvage-Weg unter Verwendung von Nicotinamid (NAM) und den Preiss-Handler-Weg unter Verwendung von Nicotinsäure (NA). Da es bei Säugetieren mehrere Mechanismen zur Synthese von NAD+ gibt, bleiben die spezifischen Wege, die für verschiedene Gewebe verwendet werden, und der effektivste Weg unklar9,10. In der Darmflora gibt es einen weiteren wichtigen Weg, der NAM in NA umwandelt und dabei den Salvage- und Preiss-Handler-Weg kombiniert, der als Desamidierung bekannt ist und durch PncA11 katalysiert wird. Kürzlich wurde gezeigt, dass dieser Prozess ein wichtiger Schritt für die Darmflora ist, um den NAD+-Spiegel des Wirts zu regulieren12. Man geht davon aus, dass dieser durch PncA katalysierte Weg im Laufe der biologischen Evolution aufgegeben wurde, da bei höheren Säugetieren kein Homolog dieses Gens identifiziert wurde. Daher wurde bisher bei Säugetieren kein Enzym gefunden, das die Umwandlung von NAM in NA katalysiert9. Basierend auf diesen Eigenschaften wurde Pyrazinamid zur Behandlung von Mycobacterium tuberculosis13 entwickelt, ein Medikament, das PncA zur Umwandlung in seine aktive Form benötigt.

NAFLD ist die häufigste chronische Lebererkrankung und steht in engem Zusammenhang mit dem metabolischen Syndrom. Aufgrund erheblicher Veränderungen in der Ernährung und im Lebensstil hat die Prävalenz von NAFLD weltweit deutlich zugenommen14. Derzeit stehen jedoch keine wirksamen, von der FDA zugelassenen Medikamente für den klinischen Einsatz zur Verfügung. Daher bleibt die Erforschung vielversprechender therapeutischer Ziele oder Strategien eine Priorität15. Mehrere Studien haben gezeigt, dass eine Ergänzung mit den NAD+-Vorläufern Nicotinamid-Ribonukleotid (NR), Nicotinamid-Mononukleotid (NMN) und ACMSD-Hemmung (ein Enzym, das den De-novo-NAD+-Syntheseweg blockiert) die NAFLD bei Mäusen deutlich verbessert16,17,18, was auf eine NAD+-Regulation hindeutet in der erkrankten Leber als potenzielles therapeutisches Ziel. Während der Entwicklung von NAFLD erfährt die Darmflora erhebliche Veränderungen19, und PncA in der Darmflora spielt eine wichtige Rolle bei der NAD+-Synthese in der Mausleber. Daher zielte diese Studie darauf ab, die Bedeutung von PncA bei der Regulierung des NAD+-Spiegels bei Mäusen und seinen potenziellen Anwendungswert bei der Verbesserung der NAFLD bei Mäusen zu untersuchen.

Unsere Untersuchungen ergaben, dass Pyrazincarbonitril (PCN) die PncA-Aktivität hemmte, die NAD+-Spiegel im Darm und in der Leber von Mäusen beeinflusste und die Homöostase der Darmmikrobiota störte. Die Überexpression von modifiziertem PncA bei Mäusen erhöhte den NAD+-Spiegel in der Leber signifikant und verbesserte die ernährungsbedingte NAFLD.

Wir haben die Synthese- und Verbrauchswege von NAD+ bei Säugetieren und der menschlichen Darmflora zusammengefasst (Abb. 1). Wir konnten sehen, dass PncA bei Säugetieren fehlt, aber in verschiedenen Bakterienstämmen hoch konserviert ist (ergänzende Abbildung S1), was auf seine Bedeutung für die bakterielle Synthese von NAD+ hinweist. Ergänzende Abbildung S1 zeigt auch andere Gene, die mit der NAD+-Synthese in verschiedenen Bakterienarten zusammenhängen.

Zwei Hauptwege sind an der NAD-Synthese bei Säugetieren beteiligt: der De-novo-Weg und der Salvage-Weg. Der erstere Weg wandelt Trp über den Kynurenin-Weg in QA um und synthetisiert NAD+. Die Hauptvorläufer von NAD+ sind NAM, NA, NR und NMN. Zu den NAD+-verbrauchenden Enzymen gehören hauptsächlich SIRTs, PARPs und CD38, und die Metaboliten nach dem Verbrauch von NAD enthalten alle NAM. In der Darmflora hängt die De-novo-Synthese von NAD+ hauptsächlich von Asp und nicht von Trp ab. Obwohl sie sich im De-novo-Weg unterscheiden, verwenden sie dieselben Vorläufer für die NAD+-Synthese. Die Abhängigkeit von denselben Vorläufern muss zu Konkurrenz oder Kooperation im NAD+-Metabolismus zwischen Säugetieren und ihrer Mikrobiota führen. Der durch die rote Linie markierte Syntheseweg ist spezifisch für die Darmflora. Trp-Tryptophan, ACMS α-Amino-β-carboxymuconat-ε-semialdehyd, QA Chinolinsäure, AMS α-Amino-β-muconat-ε-semialdehyd, NaAD Nikotinsäureadenindinukleotid, MNAM-Methylierung von NAM, Asp-Asparaginsäure, ImminoAsp immino -Aspartat, QPRT-Nikotinat-Nukleotid-Pyrophosphorylase, NMNAT Nikotinamid/Nikotinsäure-Mononukleotid-Adenylyltransferase, NADS-Glutamin-abhängige NAD+-Synthetase, NNMT-Nikotinamid-N-Methyltransferase, NRK-Nikotinamid-Ribosidkinase, NADP-Nikotinamidadenindinukleotidphosphat. Abbildung 1 wurde mit Adobe Illustrator erstellt.

Um zu überprüfen, ob das PncA in der Mikrobiota die NAD+-Synthese im Wirt beeinflusst, verwendeten wir den PncA-Inhibitor PCN, ein Analogon des häufig zur Behandlung von Tuberkulose verwendeten Antibiotikums Pyrazinamid. Es wurde berichtet, dass PCN eine starke hemmende Wirkung auf die PncA-Enzymaktivität von Tuberkulose hat20. Die Proteinstrukturausrichtung zeigte, dass die aktiven katalytischen Stellen von PncA in Bakterien konserviert sind (ergänzende Abbildung S2a), daher spekulierten wir, dass PCN auch in anderen Bakterien funktionieren würde. Ein Enzymtest von gereinigtem PncA von E. coli zeigte auch, dass PCN seine Desaminierungsaktivität stark inhibierte (Ergänzende Abbildungen S2b und c). Um den Einfluss von PCN auf das Bakterienwachstum in vitro zu verifizieren, haben wir mehrere Bakterien mit unterschiedlichen NAD+-Synthesewegen ausgewählt, darunter Bifidobacterium longum, das sowohl De-novo-Synthese- als auch Preiss-Handler-Wege aufweist; Akkermansia muciniphila, das nur über den De-novo-Syntheseweg verfügt; und Lactobacillus salivarius und Streptococcus gordonii, die nur den Preiss-Handler-Weg haben (ergänzende Abbildung S1). Diese drei Arten von Bakterien kommen in der Darmflora von Säugetieren häufig vor. Die Wachstumsraten von A. muciniphila und B. longum blieben nach der PCN-Behandlung nahezu unverändert (Abb. 2a), während das Wachstum von L. salivarius und S. gordonii, das nur vom Preiss-Handler-Weg abhing, stark gehemmt wurde. Dies zeigt, dass PCN eine starke Hemmwirkung auf Bakterien hat, die vom Preiss-Handler-Weg abhängig sind. Obwohl B. longum über das PncA-Gen verfügt, hatte PCN nur einen minimalen Einfluss auf sein Wachstum, was darauf hindeutet, dass B. longum NAD+ hauptsächlich über den De-novo-Weg synthetisiert.

a Auswirkungen von PCN auf das Wachstum von Bakterien mit unterschiedlichen NAD+-Synthesewegen. b PCA-Diagramm der Darmflora bei mit PCN behandelten Mäusen (n = 7). c Darmmikrobenarten und -vielfalt nach PCN-Behandlung bei Mäusen (n = 7, *p < 0,05). d–f NAD+-Spiegel in Leber, Darm und Hippocampus von Mäusen (n = 6, *p < 0,05, ns = keine Signifikanz).

Im In-vivo-Experiment behandelten wir Mäuse mit PCN und sammelten am letzten Tag des Experiments den Kot jeder Gruppe. Anschließend analysierten wir mithilfe der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie die Veränderungen in der Darmflora von Mäusen. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) zeigte, dass die PCN-Behandlung einen signifikanten Einfluss auf die Darmmikroben von Mäusen hatte (Abb. 2b). Überraschenderweise zeigten mit PCN behandelte Mäuse im Vergleich zu Kontrollmäusen einen signifikanten Anstieg des Bakterienreichtums (Abb. 2c). Als mögliche Erklärung vermuten wir, dass PCN das ursprüngliche Gleichgewicht in der Darmflora stört, was zu einer massiven Vermehrung einiger Bakterien führt. Auf Artenebene erhöhte PCN die Häufigkeit von Helicobacter hepaticus, Clostridium cocleatum und B. pseudolongum signifikant (ergänzende Abbildung S3a). Außerdem nahm die Häufigkeit von Bacteroidales signifikant zu, wohingegen die Häufigkeit von Clostridiales signifikant abnahm (ergänzende Abbildung S3b). Aufgrund der komplexen Zusammensetzung und gegenseitigen Abhängigkeit der Darmmikrobiota konnten wir jedoch keinen Zusammenhang zwischen diesen Bakterien und ihrem NAD+-Syntheseweg feststellen. Darüber hinaus hemmte PCN den Elektronentransfer, die Atmung und andere eng mit NAD+ verbundene Wege in der Darmflora erheblich (ergänzende Abbildung S3c). Ergänzende Abbildung S3d zeigt, dass NAM im Kot von Mäusen nach der PCN-Behandlung zunahm, während NA abnahm. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass PCN einen erheblichen Einfluss auf die Darmflora hat.

Da PncA in der Darmflora eine wichtige Rolle bei der Synthese von NAD+ im Darm und in der Leber des Wirts spielt, untersuchten wir die Auswirkungen der PCN-Behandlung auf den NAD+-Spiegel in Leber und Darm von Wirtsmäusen. PCN reduzierte die Verwertungseffizienz von NAM in Leber und Darm des Wirts, was zu einem niedrigeren NAD+-Spiegel führte (Abb. 2d und e). Da PncA die Umwandlung von NAM in NA katalysiert, vermuteten wir, dass die NAD+-Synthese mit NA effizienter ist als die mit NAM in Leber und Darm. Es ist bekannt, dass NAM produziert wird, wenn NAD+-abhängige Enzyme NAD+ verbrauchen, und eine zusätzliche Nahrungsergänzung steigert die NAD+-Synthese nicht. Überraschenderweise reduzierte PCN im Fall der NAM-Supplementierung auch den NAD+-Spiegel im Hippocampus im Vergleich zur PBS-Gruppe (Abb. 2f). Den Ergebnissen der RNA-Sequenzierung (RNA-seq) zufolge beeinflusste PCN die Expression zahlreicher Gene in der Leber (ergänzende Abbildung S4a) und beeinflusste die Immunprozesse des Wirts erheblich, wie beispielsweise das intestinale Immunnetzwerk für die IgA-Produktion und Antigenverarbeitung (ergänzende Abbildung S4a). S4b). Um zu zeigen, dass PCN den NAD+-Spiegel im Wirt durch seine Wirkung auf die Darmflora reguliert, anstatt den Wirt direkt zu beeinflussen, wurden 293T-, HepG2-Zellen und mit Antibiotika behandelte Mäuse mit PCN behandelt. Die Ergebnisse zeigten, dass PCN keinen Einfluss auf das Wachstum und den NAD + -Spiegel menschlicher Zellen sowie des mit Antibiotika behandelten Dickdarms und der Leber von Mäusen hatte (ergänzende Abbildung S5a – d).

Unsere bisherigen Experimente und die Forschung von Shats et al. zeigten, dass das PncA-Gen in der Darmflora eine wichtige Rolle bei der Regulierung von NAD+ im Wirt spielt. Daher haben wir versucht, die Synthese von NAD+ bei Säugetieren mithilfe eines neuen Ansatzes zu fördern. Wir wollten zunächst Bakterien ergänzen, die speziell auf den NAD+-Syntheseweg der Desamidierung angewiesen sind. Die Kontrolle univariater Variablen für dieses Experiment war jedoch eine Herausforderung, daher konstruierten wir E. coli mit Überexpression von PncA (PncA-OE) und verwendeten normale E. coli-Stämme nur mit Vektor (PncA-WT) als Kontrolle. Basierend auf der Genexpression, Proteinquantifizierung und dem Enzymassay von PncA in verschiedenen E. coli (Ergänzende Abbildung S6a – c) wurde PncA in der PncA-OE-Gruppe funktionell induziert.

Zuerst führten wir ein In-vitro-Experiment durch. NAM (0,5 mM) wurde dem Kulturmedium von E. coli zugesetzt, das kultiviert wurde, bis die optische Dichte (OD) 1,0 erreichte. Anschließend wurden die Bakterien zentrifugiert und der Überstand zur Metabolomanalyse gesammelt (Abb. 3a). Wie erwartet setzte PncA-OE E. coli mehr NA im Bakterienkulturmedium frei als PncA-WT E. coli (Abb. 3b). Um die Kolonisierung von exogenen E. coli im Darm von Mäusen in vivo zu erleichtern, behandelten wir Mäuse zunächst 5 Tage lang mit einem Antibiotika-Cocktail, um endogene Bakterien zu reduzieren. Als nächstes wurden die Mäuse mit PncA-OE und PncA-WT E. coli gefüttert und in NAM-ergänzte und nicht NAM-ergänzte Gruppen aufgeteilt (Abb. 3c). Frühere Studien zeigten, dass die Effizienz der NA-Nutzung für die NAD+-Synthese in der Leber höher ist als die von NAM21. Wir fanden heraus, dass der NAD+-Spiegel in der Mäuseleber in der PncA-OE E. coli-Gruppe unter der Bedingung der NAM-Ergänzung höher war als in der Kontrolle (Abb. 3d).

a Schematische Darstellung des In-vitro-Experiments (erstellt von Adobe Illustrator). b Heatmap der Metaboliten im Bakterienkulturmedium. c Schematische Darstellung des Mausexperiments. d Leber-NAD+-Spiegel nach Kolonisierung von Mäusen mit verschiedenen E. coli-Genotypen (n = 6, *p < 0,05, ns = keine Signifikanz).

Durch die Steigerung der NAD+-Synthese in der Leber wird die NAFLD deutlich verbessert. Daher konstruierten wir NAFLD-Modellmäuse unter Verwendung einer Methionin- und Cholin-defizienten (MCD) Diät, um zu überprüfen, ob PncA-OE E. coli NAFLD verbessern kann. Die MCD-Diät verringerte schnell das Körpergewicht der Mäuse (Abb. 4a) und verursachte physiologische Leberläsionen (Abb. 4b). Die MCD-Diät reduzierte auch die NAD+- und ATP-Spiegel in der Leber signifikant (Abb. 4c und d) und erhöhte die Triglyceride in der Leber (Abb. 4e). Darüber hinaus waren nach der Supplementierung mit PncA-OE E. coli die NAD+- und ATP-Spiegel in der Leber im Vergleich zur Kontrollgruppe leicht, jedoch nicht signifikant erhöht (Abb. 4c und d). PncA-OE E. coli löste die Läsionen in der Leber nicht auf (Abb. 4b). Dies könnte durch die niedrige Kolonisierungsrate von E. coli bei Mäusen und die geringe Transformationseffizienz von NAM zu NA durch PncA-OE E. coli verursacht worden sein, da wir während der Ergänzung mit PncA-OE E. coli keine Anreicherung von NA im Kot beobachteten (Ergänzende Abbildung S6d).

a Körpergewicht von MCD-induzierten NAFLD-Modellmäusen (n = 6). b Repräsentative Oil Red O-Färbung (oben) und Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) (unten) von Mäuseleberschnitten. c Leber-NAD+-Spiegel in NAFLD-Modellmäusen, die mit verschiedenen Bakterien behandelt wurden. d Relativer ATP-Gehalt in der Mäuseleber. e Gehalt an Triglyceriden in der Mausleber. (n = 6, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, ns = keine Signifikanz). Maßstabsbalken 100 µm.

Wir fanden heraus, dass eine Ergänzung mit PncA-OE E. coli bei der Linderung von NAFLD nicht wirksam war. Wir spekulieren jedoch, dass dies an der begrenzten Kolonisierungsfähigkeit von Bakterien zur Förderung von NAD+ in der Leber liegen könnte. Anstatt Bakterien zu verwenden, haben wir daher die Sequenz von PncA von E. coli für die direkte Expression in Säugetieren optimiert. Ein leberspezifisches Adeno-assoziiertes Virus (AAV) wurde konstruiert, um PncA über eine Schwanzveneninjektion in Mäuse zu transportieren. PncA wurde in der Mäuseleber stark exprimiert (Abb. 5a). Interessanterweise war der NAD+-Spiegel in der AAV-PncA-Gruppe deutlich höher als in der Vektorgruppe und sogar etwa fünfmal höher als in der Gruppe mit normaler Ernährung (Abb. 5b). Dies war besonders überraschend, da die weit verbreiteten und hocheffizienten NAD+-Vorläufer NR und NMN den NAD+-Spiegel in der Leber nur um das 1,5- bis 2-fache erhöhten10. Frühere Studien haben jedoch nicht gezeigt, dass NA einen so starken NAD+-Booster-Effekt auf die Mausleber hat22,23. Durch den Vergleich unserer Ergebnisse mit anderen spekulieren wir, dass die Wirkung von NA auf die NAD+-Synthese durch die Absorptionseffizienz von NA durch Leberzellen begrenzt sein könnte. Die PncA-Expression in der Leber fördert die Umwandlung von NAM zu NA in Zellen und maximiert so die Synthese von NA zu NAD+. Dies legt nahe, dass die Nikotinamidase PncA, die offenbar während der Entwicklung des NAD+-Synthesewegs aufgegeben wurde, das Potenzial für die NAD+-Synthese bei Säugetieren hat.

eine PncA-Expression in der Mausleber in der Kontroll- und PncA-Gruppe (n = 3, ****p < 0,0001). b Relativer Gehalt an NAD+ in der Mäuseleber. c Relativer ATP-Gehalt in der Mäuseleber. d Triglyceridgehalt in der Mäuseleber. (n = 6, **p < 0,01, ****p < 0,0001).

Darüber hinaus zeigten Mäuse, die PncA exprimierten, im Vergleich zur Vektorgruppe nach Ergänzung mit der MCD-Diät einen signifikanten Anstieg des ATP-Spiegels und einen verringerten Triglyceridgehalt (Abb. 5c und d). Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse der Oil Red O- und H&E-Färbung, dass die Überexpression von PncA in der Mäuseleber NAFLD-induzierte pathologische Veränderungen verbesserte (Abb. 6a). Die RNA-seq-Analyse zeigte, dass die Expression einiger am Lipidstoffwechsel beteiligter Gene signifikant verändert war (ergänzende Abbildung S7a), und die Gen-Set-Anreicherungsanalyse ergab, dass PncA die Expression von Genen erhöhte, die hauptsächlich am PPAR-Signalweg, dem Fettsäureabbau, beteiligt sind. und andere Wege, die den Fettstoffwechsel fördern (Abb. 6b). Basierend auf der Metabolomanalyse zeigte PCA signifikante Unterschiede zwischen der PncA- und der Vektorgruppe (ergänzende Abbildung S7b), und das Vulkandiagramm zeigte eine große Anzahl unterschiedlicher Metaboliten zwischen den beiden Gruppen (ergänzende Abbildung S7c). Die NA-Konzentration in der Leber der PncA-Gruppe war signifikant erhöht (Abb. 6c), und die Spiegel anderer kleiner Moleküle, die am Nikotinat- und Nikotinamid-Metabolismus beteiligt sind, waren ebenfalls signifikant verändert (ergänzende Abb. S7d). Metaboliten, die sich zwischen den beiden Gruppen unterschieden, waren hauptsächlich in den Stoffwechselwegen Nikotinat und Nikotinamid angereichert, gefolgt von der Biosynthese von Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan sowie anderen Stoffwechselwegen im Zusammenhang mit dem Lipidstoffwechsel (ergänzende Abbildung S7e). Die Rohdaten der Metabolomanalyse sind in den Zusatzdaten 1 aufgeführt. Zu unserer Überraschung waren die stark exprimierten Gene in der PncA-Gruppe auch in den Differenzierungswegen der Th1- und Th2-Zellen signifikant angereichert, was darauf hinweist, dass PncA-Gene möglicherweise eine wichtige Rolle bei der T-Zell-Differenzierung spielen (Abb. 6d).

a Repräsentative Oil Red O-Färbung (oben) und H&E-Färbung (unten) von Mäuseleberschnitten. b Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) der RNA-seq-Ergebnisse. c Heatmaps von Metaboliten mit signifikanten Unterschieden zwischen der PncA- und der Vektorgruppe. d GSEA der RNA-seq-Ergebnisse. Maßstabsbalken 100 µm.

Um zu überprüfen, dass eine direkte NA-Supplementierung bei Mäusen den Effekt der Expression von PncA in der Leber nicht rekapituliert, behandelten wir Mäuse mit der MCD-Diät und NA. Das Körpergewicht der Mäuse nahm während des Experiments ab (ergänzende Abbildung S8a), und NA hatte keinen offensichtlichen Einfluss auf den NAD+-Spiegel in der Leber (ergänzende Abbildung S8b). Daher erhöht eine direkte NA-Supplementierung den NAD+-Spiegel der Maus nicht.

Coenzym NAD+ spielt eine Schlüsselrolle in der Zellbiologie und bei adaptiven Stressreaktionen. Sein Abbau ist ein Grundmerkmal des Alterns und kann zu verschiedenen chronischen Krankheiten führen24. Eine NAD+-Supplementierung lindert mehrere altersbedingte Krankheiten und verlängert sogar die Lebensdauer von Mäusen25. Die Aufrechterhaltung des NAD+-Spiegels ist für die Funktion von Zellen mit hohem Energiebedarf und reifen Neuronen von wesentlicher Bedeutung26. Bei schweren neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit und Muskelatrophie ist der NAD+-Spiegel deutlich verringert27. Zunehmende Beweise zeigen, dass NAD+ in verschiedenen Geweben während des Alterns deutlich reduziert wird, und die Frage, wie der zelluläre NAD+-Spiegel durch physiologische und pharmakologische Methoden effizient erhöht und altersbedingte Krankheiten verhindert werden können, ist in den letzten Jahren zu einem heißen Forschungsthema geworden. Ebenso ist die Identifizierung neuer und effizienter Methoden zur Förderung der NAD+-Synthese von entscheidender Bedeutung.

Derzeit ist der effizienteste NAD+-Syntheseweg bei Säugetieren umstritten. Darüber hinaus sind verschiedene Organe auf unterschiedliche NAD+-Vorläufer angewiesen23. Studien haben gezeigt, dass Leber und Nieren alle drei NAD+-Synthesewege nutzen; Milz, Dünndarm und Bauchspeicheldrüse sind hauptsächlich auf die Wiederherstellung von NA und NAM angewiesen, während Herz, Lunge, Gehirn, Muskeln und weißes Fettgewebe hauptsächlich den NAM-Weg nutzen28. In Bezug auf den effizientesten Vorläufer wurde in einigen Artikeln berichtet, dass die Effizienz der NAD+-Synthese mit NA höher ist als die mit NAM, es gibt jedoch noch keine klare Schlussfolgerung29. Die am häufigsten verwendeten NAD+-Vorläufer sind jedoch NR und NMN. Nachdem diese beiden Vorläufer in die Zelle gelangt sind, wird NAD+ durch eine oder zwei enzymatische Reaktionen synthetisiert und vermeidet die Beeinflussung durch geschwindigkeitsbestimmende Enzyme wie Nicotinat-Phosphoribosyltransferase (NAPRT) und Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase (NAMPT). Diese beiden Vorläufer wurden für verschiedene Interventionen eingesetzt, beispielsweise zur Linderung neurodegenerativer Erkrankungen, zur Verbesserung des Hörvermögens, zur Behandlung von Diabetes und NAFLD, zur Verzögerung des Alterns und zur Verlängerung der Lebensdauer30,31,32,33,34.

Zellen haben unterschiedliche Absorptionseffizienzen für verschiedene NAD+-Vorläufer. NAM gelangt durch freie Diffusion direkt in die Zelle, wohingegen NA, NR, NMN und andere Vorläufer die Unterstützung von Membranproteinen benötigen, was zu einer geringeren Absorptionseffizienz im Vergleich zu NAM35 führt. Es wird jedoch angenommen, dass NAM im Körper in ausreichender Menge vorhanden ist, da NAD+ unter Bildung von NAM zersetzt wird, das wieder in den NAD+-Syntheseweg eintritt. Darüber hinaus ist NAM ein Inhibitor der SIRT-Familie. Übermäßige NAM-Konzentrationen hemmen die Aktivität von SIRT2 und verkürzen die Lebensdauer von Saccharomyces cerevisiae36. Allerdings schützt die Überexpression von PncA in Drosophila Neuronen und verlängert ihre Lebensdauer37. PncA verlängert auch die Lebensdauer von Caenorhabditis elegans38. In dieser Studie verwendeten wir leberspezifisches AAV, um PncA in der Leber zu exprimieren, einem Organ, das auf mehrere NAD+-Vorläufer angewiesen ist. Auf diese Weise haben wir die Leber mit der Nikotinamidase wieder aufgefüllt, die während der Evolution entsorgt wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass der Preiss-Handler-Weg in Säugetierzellen hochaktiv war und dieser Ansatz den NAD+-Spiegel stärker erhöhte als NR oder NMN, was auf die hohe Effizienz von NA für die NAD+-Synthese hinweist.

Darüber hinaus scheint die Effizienz der Verwendung von NA für die NAD+-Synthese in der Leber am höchsten zu sein. Darüber hinaus kann PncA überschüssiges NAM in der Leber verarbeiten, wodurch die Hemmung von SIRT1 durch NAM aufgehoben und die Aktivität von SIRT1 erhöht wird, was einer weiteren Überprüfung bedarf. Basierend auf den obigen Ergebnissen spekulieren wir, dass PncA auch die NAD+-Spiegel in anderen Organen, die für die NAD+-Synthese auf NA angewiesen sind, erheblich erhöht. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass PncA die NAFLD bei Mäusen signifikant verbesserte, was darauf hindeutet, dass PncA ein vielversprechendes potenzielles Ziel für die Behandlung verschiedener Krankheiten im Zusammenhang mit NAD+-Mangel darstellt. Es gibt einige Einschränkungen in unserer Arbeit; Keimfreie Mäuse wären ein idealeres Forschungsmodell für ergänzende Experimente mit Bakterien, und ein konstitutiver bakterieller Expressionsvektor wäre eine hocheffiziente Methode zur Proteinüberexpression in vivo, was erklären könnte, warum wir keinen Anstieg von NA im Kot beobachteten. Darüber hinaus sollten weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um die möglichen Nebenwirkungen zu bewerten, die durch einen übermäßigen Anstieg von NAD+ nach einer PncA-Überexpression verursacht werden.

NAM (HY-B0150), NA (HY-B0143) und NR (HY-123033) wurden von MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, USA) erhalten. PCN (243-369-5) wurde von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) und die MCD-Diät (TD.90262) von Harlan Teklad bezogen. Hirn-Herz-Infusion (BHI) (HB8297-5), MRS (HB0384-1) und TPY (HB8570) wurden von Hopebio-Technology (Qingdao, China) bezogen.

293T weibliche embryonale Nierenzellen und HepG2-Leberkrebszellen wurden von ATCC erhalten und in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 100 mg/ml Penicillin/Streptomycin, kultiviert . Jede Zelllinie wurde in einer 5 % CO2-Atmosphäre bei 37 °C gehalten. Der Mykoplasmen-Kontaminationsstatus aller Kulturen wurde monatlich mittels PCR überwacht.

Akkermansia muciniphila (ATCC BAA-835) und L. salivarius (ATCC 1174) wurden anaerob in BHI- bzw. MRS-Medium kultiviert. Bifidobacterium longum (1.2186) und S. gordonii (1.2496) wurden vom China General Microbiological Culture Collection Center (Peking, China) bezogen und anaerob in TPY- bzw. BHI-Medium kultiviert.

Wildtyp-C57BL/6J-Mäuse wurden von Cyagen Biosciences Inc (Suzhou, China) gekauft. Die Mäuse wurden einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus ausgesetzt und in der speziellen pathogenfreien Einrichtung des Labortierforschungszentrums der Tongji-Universität mit einer Standard-Futternahrung gefüttert. Für die bakterielle und AAV-Infektion wurden 8 bis 10 Wochen alte weibliche C57BL/6J-Mäuse verwendet. Alle Experimente wurden gemäß den nationalen Richtlinien für die Unterbringung und Pflege von Labortieren (Gesundheitsministerium, China) durchgeführt und das Protokoll entsprach den institutionellen Vorschriften nach Prüfung und Genehmigung durch das Institutional Animal Ethics Committee am Laboratory Animal Research Center, Tongji Universität (TJAA09220102). Die Mäuse wurden vor Beginn des Experiments für einen Zeitraum von 7 Tagen akklimatisiert.

Acht Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse wurden entweder mit normalem Wasser oder autoklaviertem Wasser gefüttert, das einen Antibiotika-Cocktail (1 g/L Ampicillin, 1 g/L Neomycin, 1 g/L Metronidazol und 500 mg/L Vancomycin) enthielt 5 Tage und dann regelmäßig Wasser gegeben. Escherichia coli-Stämme wurden wie oben beschrieben kultiviert und vor der Infektion quantifiziert. Für bakterielle Kolonisierungstests wurden die Mäuse bis zum Ende des Experiments alle 3 Tage intragastrisch mit 1 × 109 cfu PncA-OE- oder PncA-WT-E. coli-Stämmen (in 0,2 ml PBS) infiziert. Für die Gruppe mit NAD+-Vorläufern wurden NAM (400 mg/kg/Tag) und NA 400 mg/kg/Tag per Magensonde verabreicht. AAV (1 × 1012 pfu/ml in 100 μl PBS), das PncA (AAV-PncA) oder einen Vektor (AAV-Vektor) exprimiert, wurde Mäusen über die Schwanzvene injiziert. Die Tiere wurden 60 Tage nach der Injektion getötet. Die Leber wurde entnommen und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Es wurden acht Wochen alte weibliche C57BL/6J-Mäuse verwendet. Nach der Akklimatisierung wurden die Mäuse anhand ihres Körpergewichts randomisiert und in drei Gruppen eingeteilt; zwei erhielten die MCD-Diät und einer erhielt eine normale Kontrolldiät. Für das Bakterienexperiment wurde die MCD-Diät 30 Tage nach der ersten Bakterienbesiedelung ergänzt. Für das AAV-Experiment wurde die MCD-Diät 40 Tage nach der AAV-Injektion ergänzt. Dann, 2,5 Wochen nach Beginn der Spezialdiät, wurden die Tiere 4 Stunden lang gefastet und mit Isofluran betäubt. Isolierte Gewebe wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und für spätere Experimente bei –80 °C gelagert. Das Experiment wurde zweimal durchgeführt.

Zur Reinigung von PncA wurde das His-tag-Protein-Reinigungskit (P2226) von Beyotime (Peking, China) verwendet. Die PncA-Aktivität wurde anhand der Ammoniakproduktion bestimmt, die mit dem Ammoniak-Assay-Kit (MAK310) von Sigma-Aldrich nachgewiesen wurde. In einem typischen Assay wurden 100 mM HEPES, pH 7,4, enthaltend 500 μM Nicotinamid und 37,5 nM PncA bei 27 °C kombiniert. Die Zugabe von Enzym löste die Reaktion aus und nach 15 Minuten wurde Ammoniak nachgewiesen. Der Umfang der Umwandlung von NAM durch PncA wurde anhand der Ammoniakproduktion berechnet. Für den bakteriellen Enzymtest wurde die Lyse von E. coli verwendet.

Acht Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse wurden zwei Wochen lang täglich entweder mit PBS oder PCN (150 mg/kg) per Magensonde gefüttert. Frischer Kot wurde am 15. Tag schnell gesammelt und bis zur Verarbeitung zur DNA-Extraktion und anderen Prozessen bei –80 ° C gelagert. Am Ende des Experiments wurden die Tiere getötet. Die Gewebe wurden entnommen und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert. Für die Zell- und Bakterienexperimente wurde eine PCN-Konzentration von 100 μg/ml verwendet.

Für PncA-OE E. coli wurde das PCR-Produkt eines His-markierten PncA in den pET-28a-Vektor kloniert, um das Expressionsplasmid zu konstruieren, das durch Sanger-Sequenzierung validiert wurde. Das Plasmid pET-28a-PncA wurde in E. coli BL21 (DE3) transformiert, das in LB-Brühe mit Kanamycin (50 µg/ml) bei 37 °C und Schütteln bei 220 U/min kultiviert wurde. Der LB-Brühe wurde Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (0,5 mM) zugesetzt, um die PncA-Expression während der logarithmischen Wachstumsphase zu induzieren (OD600 ~0,6). Die Bakterien wurden geerntet, als die OD600 > 1 war. Die Zellen wurden durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 5000 × g pelletiert und in PBS resuspendiert. Die Bakterien wurden gezählt und in 30 % Glycerin bei –80 °C gelagert. Die Überexpression von PncA in E. coli wurde durch qPCR und Western Blot validiert.

Die vorübergehende Transfektion wurde mit LipoFiter 3.0 (Hanbio Biotechnology Co. Ltd, Shanghai, China) durchgeführt.

293T-Zellen wurden verwendet, um Adenoviren mithilfe eines Drei-Plasmid-Systems zu verpacken, einschließlich pAAV-RC, pHelper und Shuttle-Plasmiden (mit oder ohne Zielgen). 293T-Zellen wurden zur Transfektion in 100-mm-Platten subkultiviert. Die Transfektion wurde durchgeführt, als die Zelldichte 80–90 % mit den folgenden Transfektionskomplexreagenzien erreichte: pAAV-RC 10 µg, pHelper 20 µg, Shuttle-Plasmid 10 µg und Lipofiter™ (HB-TRCF-1000, Hanbio Biotechnology Co. Ltd, Shanghai, China) 120 µl. Frisches Komplettmedium mit 10 % FBS wurde 6 Stunden nach der Transfektion ersetzt. 72 Stunden nach der Transfektion wurden die AAV-Partikel enthaltenden Zellen vorsichtig mit einem Zellschaber entfernt, in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt und 3 Minuten lang bei 150 × g zentrifugiert. Die Zellen wurden gesammelt und der Kulturüberstand entfernt. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und mit 300 μl PBS resuspendiert. Die Zellen wurden dreimal in flüssigem Stickstoff und bei 37 °C eingefroren und aufgetaut und 5 Minuten lang bei 4 °C und 2000 × g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Der AAV-Partikel enthaltende Lyseüberstand wurde gesammelt und 0,1 μl Benonase (9025-65-4, Merck, Darmstadt, Deutschland) zu jeweils 1 ml rohem Virusextrakt hinzugefügt, um das Zellgenom und die Plasmid-DNA zu entfernen. Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei 4 °C und 600 × g zentrifugiert und der Überstand zur Säulenreinigung gesammelt (V1469-01, Biomiga, San Diego, CA, USA). Die durch die Säule gereinigten 4-ml-AAV-Flüssigkeitsproben wurden in das Ultrafiltrationsröhrchen gegeben und 30 Minuten lang bei 1400 × g zentrifugiert, um etwa 1 ml gereinigtes AAV zu erhalten, das bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert wurde.

Wir haben einige häufige mikrobielle Flora und pathogene Bakterien von Säugetieren aus verschiedenen Klassifikationen ausgewählt und die Gene untersucht, die mit der NAD+-Synthese in ihren Genomen verbunden sind. Quinolinatsynthetase (nadA) katalysiert den zweiten Schritt des De-novo-Biosynthesewegs der Pyridinnukleotidbildung, der eine nadA-Domäne enthält. Ein verstecktes Markov-Modell (HMM) der nadA-Domäne wurde von pfam39 heruntergeladen und zur Identifizierung homologer nadA-Proteine mithilfe der hmmsearch-Funktion aus dem HMMer 3.1-Paket40 gegen das von uns ausgewählte bakterielle Proteom verwendet. Übereinstimmungen mit E ≤ 10−5 und einer Annotation einschließlich Quinolinat-Synthetase wurden als Kandidaten für nadA erkannt. BlastP (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE = Proteins) wurde verwendet, um die Kandidaten anhand des Schwellenwerts E ≤ 10−5 zu screenen, und die Proteine, die diese beiden Schwellenwerte überschritten, wurden erkannt als nadA. Die Identifizierung von nadC, nadD, nadE, PncA, PncB und Sirt2 verlief ähnlich wie die von nadA. Allerdings hatten nadB, nadR und nadN keine Signaturdomäne, sodass die HMM-Methode zur Identifizierung dieser Gene nicht geeignet war. Proteinsequenzen dieser Gene von E. coli wurden als Samen verwendet, die BlastP gegen das von uns ausgewählte Bakterienproteom unterzogen wurden; Proteine mit einem E-Wert von weniger als 10−5 und entsprechender Annotation wurden als entsprechende Gene erkannt.

Für Bakterienüberstände wurden die Proben in einem Eiswasserbad aufgetaut und 30 s lang gevortext. Ein 100-μl-Aliquot jeder einzelnen Probe wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt. Nach Zugabe von 400 μl Extraktlösungsmittel (vorgekühlt auf –40 °C, Acetonitril-Wasser, 5:3, enthaltend 0,125 % Ameisensäure und isotopenmarkierten internen Standard) wurden die Proben 30 s lang gevortext. Die Proben wurden 15 Minuten lang in einem Eiswasserbad beschallt, anschließend 1 Stunde lang bei –20 °C inkubiert und 15 Minuten lang bei 12.000 U/min (relative Zentrifugalkraft (RCF) = 13.800 × g) und 4 °C zentrifugiert. Ein 400-μl-Aliquot des Überstands wurde unter einem sanften Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft und in 80 μl 1 % Methanol/Wasser (v/v) rekonstituiert. Nachdem die Proben 15 Minuten lang bei 4 °C mit 12.000 U/min (RCF = 13.800 × g, R = 8,6 cm) zentrifugiert wurden, wurde der klare Überstand einer LC-MS/MS-Analyse unterzogen.

Für Mäusekot wurde ein Aliquot jeder einzelnen Probe gewogen und in ein Eppendorf-Röhrchen überführt. Nach Zugabe von zwei kleinen Stahlkugeln und 1000 μl Extraktionslösung (vorgekühlt bei –40 °C, 50 % Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure und isotopenmarkiertem internen Standard) wurden die Proben 30 s lang gevortext, 4 min lang bei 40 Hz homogenisiert, und 5 Minuten lang in einem Eiswasserbad beschallt. Die Homogenisierungs- und Ultraschallzyklen wurden dreimal wiederholt, gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei –20 °C und einer 15-minütigen Zentrifugation bei 12.000 U/min (RCF = 13.800 × g, R = 8,6 cm) bei 4 °C. Ein 800-μl-Aliquot des Überstands wurde unter einem sanften Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft und in 80 μl 1 % Methanol/Wasser (v/v) rekonstituiert. Nachdem die Proben 15 Minuten lang bei 4 °C mit 12.000 U/min (RCF = 13.800 × g, R = 8,6 cm) zentrifugiert wurden, wurde der klare Überstand einer LC-MS/MS-Analyse unterzogen.

Für Mäuseleber wurden 50-mg-Proben abgewogen, in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben und mit 1000 μl Extraktlösung (Methanol: Acetonitril: Wasser = 2:2:1, mit einer isotopenmarkierten internen Standardmischung) versetzt. Die Proben wurden 4 Minuten lang bei 35 Hz homogenisiert und 5 Minuten lang in einem Eiswasserbad beschallt. Die Homogenisierungs- und Beschallungszyklen wurden dreimal wiederholt. Die Proben wurden 1 Stunde lang bei –40 °C inkubiert und 15 Minuten lang bei 4 °C mit 12.000 U/min zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde zur Analyse in ein frisches Glasfläschchen überführt.

LC-MS/MS-Analysen wurden unter Verwendung eines UHPLC-Systems (Vanquish; Thermo Fisher Scientific) mit einer UPLC BEH-Amidsäule (2,1 mm × 100 mm, 1,7 μm) durchgeführt, gekoppelt an ein Q Exactive HFX-Massenspektrometer (Orbitrap MS; Thermo Fisher Scientific). ). Die mobile Phase bestand aus 25 mmol/L Ammoniumacetat und 25 mmol/L Ammoniakhydroxid in Wasser (pH 9,75) (A) und Acetonitril (B). Die Temperatur des Autosamplers betrug 4 °C und das Injektionsvolumen betrug 2 μl. Das QE HFX-Massenspektrometer wurde zur Erfassung von MS/MS-Spektren im informationsabhängigen Erfassungsmodus mit Erfassungssoftware (Xcalibur; Thermo Fisher Scientific) eingesetzt. In diesem Modus wertete die Erfassungssoftware kontinuierlich das gesamte MS-Spektrum aus. Die Quellenbedingungen für den Notfallschwereindex wurden wie folgt festgelegt: Hüllgasdurchflussrate 30 Arb, Hilfsgasdurchflussrate 25 Arb, Kapillartemperatur 350 °C, volle MS-Auflösung 60.000, MS/MS-Auflösung = 7500, Kollisionsenergie 10/30/60 im normalisierten Kollisionsenergiemodus und Sprühspannung 3,6 kV (positiv) oder –3,2 kV (negativ).

Die Rohdaten wurden mit ProteoWizard in das mzXML-Format konvertiert und mit einem hauseigenen Programm (entwickelt mit R und basierend auf XCMS) zur Peakerkennung, Extraktion, Ausrichtung und Integration verarbeitet. Anschließend wurde eine hauseigene MS2-Datenbank (BiotreeDB) für die Annotation von Metaboliten verwendet. Der Grenzwert für Anmerkungen wurde auf 0,3 festgelegt.

Die Gesamt-RNA wurde mit Trizol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) aus Geweben extrahiert. Mit Oligo (dT) verbundene Magnetkügelchen wurden zur Reinigung der mRNA verwendet. Gereinigte mRNA wurde mit Fragmentpuffer bei der geeigneten Temperatur in kleine Stücke fragmentiert. Anschließend wurde die Erststrang-cDNA mittels zufälliger Hexamer-primierter Reverse-Transkription erzeugt, gefolgt von der Zweitstrang-cDNA-Synthese. Anschließend wurden A-Tailing Mix und RNA-Index-Adapter durch Inkubation hinzugefügt, um die Reparatur zu beenden. Die im vorherigen Schritt erhaltenen cDNA-Fragmente wurden durch PCR amplifiziert, und die Produkte wurden mit Ampure XP-Kügelchen gereinigt und dann in einer Elutionspufferlösung gelöst. Das Produkt wurde zur Qualitätskontrolle auf dem Bioanalysator Agilent Technologies 2100 validiert. Die doppelsträngigen PCR-Produkte aus dem vorherigen Schritt wurden erhitzt, denaturiert und durch die Splint-Oligo-Sequenz zirkularisiert, um die endgültige Bibliothek zu erhalten. Als endgültige Bibliothek wurde einzelsträngige zirkuläre DNA formatiert. Die endgültige Bibliothek wurde mit phi29 amplifiziert, um DNA-Nanokugeln zu erzeugen, die mehr als 300 Kopien eines Moleküls enthielten. DNA-Nanokugeln wurden in das strukturierte Nanoarray geladen und auf der BGIseq500-Plattform (BGI, Shenzhen, China) wurden gepaarte 50-Basenpaar-Reads generiert.

Die Sequenzierungsdaten wurden mit SOAPnuke (v1.5.2)41 gefiltert durch: (1) Entfernen von Lesevorgängen, die Sequenzierungsadapter enthalten, (2) Entfernen von Lesevorgängen mit einem Basisverhältnis niedriger Qualität (Basisqualität ≤ 5) >20 und (3) Entfernen Liest mit einem unbekannten Basenverhältnis (N'-Base) >5 %. Saubere Lesevorgänge wurden im FASTQ-Format erhalten und gespeichert und mit HISAT2 (v2.0.4)42 auf das Referenzgenom abgebildet. Bowtie2 (v2.2.5)43 wurde angewendet, um die sauberen Lesevorgänge mit dem kodierenden Referenzgensatz abzugleichen, und dann wurde das Genexpressionsniveau mit RSEM (v1.2.12)44 berechnet. Die Heatmap wurde mit Pheatmap (v1.0.8) entsprechend der Genexpression in verschiedenen Proben erstellt. Die Analyse der differentiellen Expression wurde mit DESeq2(v1.4.5)45 mit Q < 0,05 durchgeführt. Um Einblick in phänotypische Veränderungen zu gewinnen, wurden von Phyper (https:// en.wikipedia.org/wiki/Hypergeometrische Verteilung) basierend auf dem hypergeometrischen Test. Das signifikante Niveau der Begriffe und Pfade wurde mithilfe des Q-Werts mit einem strengen Schwellenwert (<0,05) durch den Bonferroni-Test korrigiert.

Die RNA wurde mit DNase behandelt und 1 μg RNA wurde für die reverse Transkription verwendet. 10-fach verdünnte cDNA wurde für die quantitative Reverse-Transkription-PCR (RT-qPCR) verwendet. RT-qPCR wurde mit dem Light-Cycler-System (Roche Diagnostics GmbH, Rotkreuz, Schweiz) und einem qPCR-Supermix (Vzayme, Nanjing, China) mit den angegebenen Primern durchgeführt. Für jeden biologischen Datenpunkt wurden durchschnittlich mindestens drei technische Wiederholungen verwendet. Das ropB-Gen wurde als Referenzgen verwendet und die folgenden Primer wurden verwendet: ropB-F, CTGCGCGAAGAAATCGAAGG, ropB-R: TTTCGCCAACGGAACGGATA und PncA-F: TGATCGCCAGCCAAGACT, PncA-R: AGCATCCAGCACCGTGAA.

Bakterien (109 KBE) wurden in 200 μl Lysepuffer (aus dem Proteinreinigungskit) lysiert. Proben von 20 μl wurden auf 12,5 % Bis-Tris-Polyacrylamidgele geladen und durch Elektroblotting auf eine PVDF-Membran (Millipore, Billerica, MA, USA) übertragen. Die Membranen wurden in Tris-gepufferter Kochsalzlösung und 0,5 % Tween mit 5 % Magermilchpulver (OXOID, Basingstoke, UK) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert und mit dem Primärantikörper Anti-His (M20001; Abmart, Shanghai, China) inkubiert. mit 1:1000-Verdünnung (500 µg/ml) über Nacht bei 4 °C. Die Membranen wurden mit Peroxidase-konjugiertem Sekundärantikörper (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Banden wurden mithilfe der verstärkten Chemilumineszenz von Millipore mit dem Detektionssystem Amersham Imager 600 (GE, Boston, USA) sichtbar gemacht.

Die DNA der mikrobiellen Gemeinschaft wurde mit einem MagPure Stool DNA KF Kit B (Magen, Guangzhou, China) extrahiert. Die DNA wurde mit einem Qubit-Fluorometer unter Verwendung eines Qubit-dsDNA-BR-Assay-Kits (Invitrogen) quantifiziert und die Qualität durch Ausführen eines Aliquots auf einem 1 %igen Agarosegel beurteilt.

Die variablen Regionen V3–V4 des bakteriellen 16S-rRNA-Gens wurden mit den degenerierten PCR-Primern 341F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) und 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) amplifiziert. Sowohl Vorwärts- als auch Rückwärtsprimer wurden mit Illumina-Adapter-, Pad- und Linkersequenzen markiert. Die PCR-Anreicherung wurde in einer 50-µl-Reaktion durchgeführt, die 30 ng Matrize, Fusions-PCR-Primer und PCR-Mastermix enthielt. Die PCR-Zyklusbedingungen waren wie folgt: 94 °C für 3 Minuten, 30 Zyklen von 94 °C für 30 Sekunden, 56 °C für 45 Sekunden, 72 °C für 45 Sekunden und eine abschließende Verlängerung für 10 Minuten bei 72 °C. Die PCR-Produkte wurden mit Ampure XP-Kügelchen gereinigt und in Elutionspuffer eluiert. Bibliotheken wurden mit dem Bioanalysator Agilent 2100 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) qualifiziert. Die validierten Bibliotheken wurden für die Sequenzierung auf einer Illumina MiSeq-Plattform (BGI) gemäß den Standardpipelines von Illumina verwendet und es wurden 2 × 300 bp Paired-End-Reads generiert.

Zunächst wurden mit der Fenstermethode mit Readfq v8 (https://github.com/cjfields/readfq) Daten geringer Qualität aus den ursprünglichen Sequenzierungsdaten entfernt. Gemeinsame Verschmutzungsablesungen und N-haltige Lesevorgänge wurden entfernt, dann wurden Lesevorgänge mit geringer Komplexität verarbeitet. Die Proben wurden anhand von Barcode und Primer unterschieden. Für den Zusammenbau wurde die FLASH-Software46 (schnelle Längenanpassung kurzer Lesevorgänge, v1.2.11) verwendet. Unter Verwendung überlappender Beziehungen wurden Paare von Double-End-Sequenzierungs-Lesevorgängen zu einer Sequenz mit Tags mit großer Fläche zusammengesetzt. Effektive Tags wurden vom UCHIME-Algorithmus erstellt und mithilfe der Software USEARCH47 (v7.0.1090) in operative taxonomische Einheiten (OTUs) gruppiert. Gemäß der Mothur-Methode und der Greengenes-Datenbank wurden taxonomische Informationen mit repräsentativen Sequenzen von OTUs annotiert. Phy-Tools48 und R-Software (v3.4.1) wurden verwendet, um eine ungewichtete Paargruppenmethode mit arithmetischer mittlerer Clusteranalyse basierend auf Bray-Curtis-gewichteten Unifrac- und ungewichteten Unifrac-Distanzmatrizen durchzuführen. Das ade449-Paket von R (v3.4.1) wurde zur Durchführung einer OTU-PCA-Analyse verwendet. Der RDP-Klassifikator-Bayesian-Algorithmus wurde verwendet, um die repräsentativen OTU-Sequenzen zu klassifizieren. Die Gemeinschaftszusammensetzung einzelner Proben wurde auf Artenebene des Stammes, der Ordnung, der Familie und der Gattung gezählt und das Histogramm der Artenhäufigkeit wurde mit dem ggplot2-Paket von R erstellt. Alpha-Diversitätsstatistiken wurden mit der Software Motor (v1. 31.2). Die Beta-Diversität wurde von QIIME (v1.80)50 analysiert. Schließlich wurde das ggplot2-Paket von R für Boxplots der Alpha- und Beta-Diversität verwendet.

Lebergewebe wurde in kleine Stücke geschnitten, 4 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert und in OCT (Leica Camera AG, Wetzlar, Deutschland) eingebettet. Mit einem Kryostaten wurden Gefrierschnitte (8 µm Dicke) angefertigt und die Proben weitere 30 Minuten mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die Objektträger wurden in destilliertem Wasser gewaschen und 15 Minuten lang mit Oil Red O gefärbt. Anschließend wurden die Objektträger 10 Sekunden lang mit Hämatoxylin gegengefärbt, um die Kerne zu identifizieren. Für die H&E-Färbung wurden die Objektträger zunächst 3–8 Minuten lang in Hämatoxylin gefärbt und dann 1–3 Minuten lang mit Eosin gegengefärbt. Die histologischen Bilder wurden mit einem Lichtmikroskop (Olympus, Tokio, Japan) aufgenommen.

Der NAD+-Nachweis wurde mit dem EnzyChrom TM NAD+/NADH+ Assay Kit (E2ND-100) von BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) durchgeführt. Die Proteinkonzentration wurde verwendet, um den NAD+-Gehalt zu normalisieren.

Zur Messung des ATP-Spiegels wurden 100 mg Leberproben in 1 ml Lysepuffer lysiert, der mit dem ATP Assay Kit (S0026) von Beyotime (Jiangsu, China) bereitgestellt wurde. Die ATP-Spiegel in der Leber wurden anhand der Luciferase-Aktivität bewertet, wie im Standardprotokoll des ATP-Assay-Kits gezeigt.

Lebertriglyceride wurden mit einem Triglycerid-Assay-Kit (E1025; Applygen Technologies, Peking, China) untersucht.

Alle Daten wurden mit GraphPad Prism 8 (Graphpad Software Inc.) analysiert. Unterschiede zwischen den beiden Gruppen wurden mithilfe des Student-t-Tests mit einer zweiseitigen Verteilung bewertet. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus mindestens drei unabhängigen Experimenten dargestellt, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Die Stichprobengrößen wurden ohne Durchführung statistischer Tests ausgewählt. Bei der abschließenden statistischen Analyse wurden keine Daten ausgeschlossen. *p < 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001 und ****p < 0,0001, sofern nicht anders angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Quelldaten, die den Abb. zugrunde liegen. 2a, 2c–f, 3d, 4a, 4c–e und 5a–d, Ergänzende Abbildungen. S2c, S3d, S5a–d, S6a, S6c, d, S7c und S8a, b werden als ergänzende Daten 2 bereitgestellt. Die in dieser Studie generierten RNA-seq-Rohsequenzierungsdatendateien sind im Sequence Read Archive (SRA) des NCBI verfügbar. unter der BioProject-Zugangsnummer PRJNA780659. Die ursprünglichen 16 S-rRNA-Sequenzdaten sind beim NCBI unter der Zugangsnummer PRJNA780391 verfügbar. Alle weiteren Daten sind beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Key Research and Development Program of China (2020YFC2002800), der National Natural Science Foundation of China (82271593) und der Fundamental Research Funds for the Central University (22120210584) unterstützt.

Institut für Regenerative Medizin, Shanghai East Hospital, Medizinische Fakultät der Tongji-Universität, 200123, Shanghai, China

Shengyu Feng, Liuling Guo, Hao Wang, Shanshan Yang und Hailiang Liu

Schlüssellabor für Phytomedizin-Ressourcen und -Nutzung in Xinjiang des Bildungsministeriums, Hochschule für Biowissenschaften, Shihezi-Universität, 832003, Shihezi, China

Hailiang Liu

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

LHL und FSY haben die Studie entworfen; FSY, YSS, WH und GLL analysierten Daten; LHL überwachte das gesamte Projekt und alle Autoren stimmten der endgültigen Fassung des Manuskripts zu.

Korrespondenz mit Hailiang Liu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Leonardo Sorci und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Kevin Theis und Zhijuan Qiu. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Feng, S., Guo, L., Wang, H. et al. Bakterielles PncA verbessert die ernährungsbedingte NAFLD bei Mäusen, indem es den Übergang von Nicotinamid zu Nicotinsäure ermöglicht. Commun Biol 6, 235 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04613-8

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Eingegangen: 04. Dezember 2021

Angenommen: 21. Februar 2023

Veröffentlicht: 02. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04613-8

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