Konformationelle Restriktion beeinflusst die Hemmung eines Multidrug-Efflux-Adapterproteins

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3900 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Membran-Effluxpumpen spielen eine wichtige Rolle bei der bakteriellen Multiresistenz. Das dreiteilige Multidrug-Efflux-Pumpensystem aus Escherichia coli, AcrAB-TolC, ist ein Ziel für die Hemmung, um die Resistenzentwicklung zu verringern und die antibiotische Wirksamkeit wiederherzustellen, mit Homologen in anderen ESKAPE-Krankheitserregern. Hier erklären wir einen Mechanismus der Hemmung des periplasmatischen Adapterproteins AcrA mithilfe einer Kombination aus Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie, zellulären Efflux-Assays und Molekulardynamiksimulationen. Wir definieren die Strukturdynamik von AcrA und stellen fest, dass ein Inhibitor eine langfristige Stabilisierung aller vier seiner Domänen bewirken kann, wohingegen ein interagierendes Effluxsubstrat nur minimale Auswirkungen hat. Unsere Ergebnisse stützen ein Modell, bei dem ein Inhibitor einen molekularen Keil innerhalb einer Spalte zwischen den Lipoyl- und αβ-Barrel-Domänen von AcrA bildet und so seine Konformationsübertragung von durch Arzneimittel hervorgerufenen Signalen von AcrB zu TolC verringert. Diese Arbeit liefert molekulare Einblicke in die Funktion von Multidrug-Adapter-Proteinen, die für die Entwicklung antimikrobieller Therapeutika wertvoll sein könnten.

Unter Multiresistenz versteht man die Fähigkeit bakterieller Krankheitserreger, tödliche Dosen vieler strukturell unterschiedlicher Verbindungen zu überleben1. Die bakterielle Multiresistenz breitet sich weiterhin mit alarmierender Geschwindigkeit aus und bedroht die menschliche Gesundheit weltweit. Im Jahr 2019 verursachten bakterielle Multiresistenzen weltweit direkt 1,27 Millionen Todesfälle, das waren mehr als HIV und Malaria zusammen2.

Ein Hauptmechanismus der Multiresistenz ist die Aktivität von Effluxpumpen3,4. Efflux-Pumpen werden häufig als Reaktion auf Antibiotika-Exposition überexprimiert und können ein breites Spektrum an chemisch unterschiedlichen Verbindungen exportieren, wodurch die intrazelluläre Antibiotika-Konzentration gesenkt und Arzneimittelresistenz verliehen wird1. Die Transporterfamilie Hydrophobic and Amphiphilic Resistance Nodulation and Cell Division (HAE-RND) spielt eine Schlüsselrolle bei der bakteriellen Multiresistenz. Escherichia coli AcrAB-TolC ist das prototypische Mitglied dieser Familie mit Homologen zu anderen gramnegativen ESKAPE-Bakterien5,6,7. Es handelt sich um einen dreiteiligen Proteinkomplex, der die Membranhülle gramnegativer Bakterien umspannt, wobei AcrB der innere Membrantransporter des Komplexes, AcrA das periplasmatische Adapterprotein (PAP) aus der Membrane Fusion Protein (MFP)-Proteinfamilie und TolC ist der äußere Membrankanal (Abb. 1a). Angetrieben durch die Protonenantriebskraft transportiert AcrB Substrate, einschließlich Antibiotika, aus der intrazellulären Umgebung zur Außenseite der Zelle, durch einen versiegelten Kanal, der von AcrA und TolC gebildet wird (Abb. 1a)8,9.

ein Schema des in die Zellhülle eingebetteten AcrAB-TolC-Komplexes. LPS-Lipopolysaccharid. b Struktur von AcrA, isoliert aus dem gesamten AcrAB-TolC-Komplex (PDB:5O66)23. c Drei Konstrukte von AcrA. AcrAL enthält Cys25, das nach der Spaltung des Signalpeptids 1-24 lipidiert wird. AcrAS enthält eine Cys25Met-Mutation und daher fehlen die Lipidierung und das Signalpeptid. AcrASD enthält zwei AcrAS-Sequenzen, die durch einen TRRIT-Linker verbunden sind. d Native-MS-Charakterisierung der AcrA-Konstrukte bei pH 6,0. Der Proteinpuffer wurde vor der MS in 100 mM Ammoniumacetatpuffer ausgetauscht. AcrAL erforderte das Vorhandensein der zweifachen kritischen Mizellenkonzentration (CMC) von DDM bei 0,03 %. AcrAL stellt eine Mischung aus Monomeren und Dimeren dar, AcrAS als Monomere und AcrASD als Dimer. Spektren, die auf biologischen Replikaten und von zwei verschiedenen nativen MS-Systemen, einem Flugzeit- und einem Orbitrap-System, gesammelt wurden, geben die Gewissheit, dass es sich bei diesen Spektralsignaturen nicht um Artefakte der Proteinpräparation oder MS-Detektion handelt67. Mit einem Sternchen (*) markierte Umschläge stellen den höheren Ladungszustand dar, der auf eine intrinsische Störung hinweist. Massen in der Ergänzungstabelle 1.

Es wurden Anstrengungen unternommen, Effluxpumpenhemmer (EPIs) gegen diese Systeme zu entwickeln, um die Aktivitäten verschiedener bereits vorhandener Antibiotika, gegen die eine Bakterienpopulation resistent geworden ist, wiederzubeleben10. Bisher lag der Schwerpunkt auf der Generierung von EPIs, die auf den AcrB-Transporter selbst abzielen. Bisher identifizierte EPIs konnten jedoch aufgrund von Toxizitätsproblemen und der promiskuitiven Natur von AcrB beim Transport seiner Inhibitoren nicht in klinische Studien gelangen11,12. Daher besteht die Notwendigkeit, andere Wege zur Generierung erfolgreicher EPIs zu erkunden, wobei sich AcrA als potenzielles Ziel für die Hemmung herausstellt10,13. Kürzlich wurde NSC 60339 durch ein gemeinsames experimentell-rechnerisches Screening als AcrA-Inhibitor identifiziert10. Frühere Arbeiten deuteten darauf hin, dass NSC 60339 eine Konformationsänderung in AcrA verursachen könnte, und schlugen eine mögliche Bindungsstelle an der Schnittstelle zwischen den Lipoyl- und αβ-Barrel-Domänen vor, die als Stelle IV bezeichnet wird (Abb. 1b)10,14. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass AcrA vielfältigere Funktionen hat und als bakterielles „Nekrosignal“ in E. coli-Schwärmen identifiziert wurde15: Wenn eine Subpopulation des Schwarms stirbt, setzen tote Zellen das Nekrosignal AcrA frei, das TolC an der Außenseite anderer bindet lebende Zellen, stimuliert den Efflux innerhalb des betroffenen Bereichs und die Hochregulierung verschiedener Effluxpumpen16. Interessanterweise haben neuere Arbeiten auch gezeigt, dass NSC 60339 die Fähigkeit zur AcrA-vermittelten Nekrosignalisierung hemmen kann16. Das Verständnis der molekularen Mechanismen der AcrA-Hemmung ist daher wichtig für die zukünftige Entdeckung von EPI- und Nekrosignal-Wirkstoffen. Ein Mechanismus der AcrA-Hemmung ist jedoch noch unklar.

AcrA fungiert als flexibles Adapterprotein zwischen AcrB und TolC, wobei seine längliche Form für diese Funktion unerlässlich ist17,18,19. Es wurde vorgeschlagen, im zusammengesetzten Komplex ein Trimer aus Dimeren zu bilden, um einen versiegelten Kanal aufrechtzuerhalten und die Konformationsbewegung von AcrB zu berücksichtigen, während es seinen Rotationsausflussmechanismus durchläuft20. Nach der Signalpeptidspaltung wird AcrA an Cys25 lipidiert, wodurch es an der inneren Membran verankert wird, obwohl frühere Studien gezeigt haben, dass das Vorhandensein der Lipideinheit für die AcrA-Funktion nicht erforderlich ist17,18,21,22. AcrA besteht aus vier linear angeordneten Domänen, den α-helikalen Haarnadel-, Lipoyl-, αβ-Fass- und Membran-proximalen (MP)-Domänen, die jeweils durch kleine flexible Linker verbunden sind (Abb. 1b). Die αβ-Barrel- und MP-Domänen interagieren mit AcrB, während die α-helikale Domäne mit den periplasmatischen, α-helikalen Coiled-Coils von TolC interagiert, wo vorgeschlagen wird, dessen „offene“ und „geschlossene“ Zustände zu regulieren23.

Hier verwendeten wir eine Kombination aus nativer und Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (nMS und HDX-MS), Simulationen der Molekulardynamik (MD), biophysikalischen und zellulären Efflux-Assays, um einen Wirkungsmechanismus für den AcrA-Inhibitor NSC 6033910,14 zu bestimmen . Unsere Ergebnisse legen nahe, dass NSC 60339 als molekularer Keil in einer Spalte zwischen den Lipoyl- und αβ-Barrel-Domänen von AcrA fungiert und dessen Strukturdynamik über alle vier Domänen hinweg verringert. Darüber hinaus untersuchten wir ein Effluxsubstrat, Novobiocin, von dem bekannt ist, dass es an AcrA bindet, den Efflux jedoch nicht hemmt, was zu einer minimalen Änderung der AcrA-Dynamik in Gegenwart von Novobiocin führt. Wir haben auch In-vivo-Efflux-Assays mit AcrA-Mutanten durchgeführt, um zu untersuchen, ob die gezielte gezielte Ausrichtung von AcrA auf das Lipoyl-αβ-Fass und die flexiblen αβ-Fass-MP-Linker den Efflux beeinflussen könnte. Dies bestätigte, dass die Lipoyl-αβ-Spalte eine medikamentöse Stelle für die gezielte Bekämpfung von AcrA während des Efflux ist, und enthüllte eine mögliche Stelle zwischen den αβ-Barrel-MP-Domänen für zukünftiges Arzneimitteldesign. Insgesamt legen unsere Ergebnisse nahe, dass NSC 60339 den Efflux durch Einschränkung der AcrA-Strukturdynamik hemmt, was die Effizienz der funktionellen Rotation von AcrAB-TolC verringern und möglicherweise die Wechselwirkungen innerhalb des Komplexes selbst während des Efflux und der Nekrosignalisierung stören könnte.

Um die periplasmatische Umgebung von AcrA am besten nachzuahmen – das Zytosol ist im Durchschnitt 1,7 pH-Einheiten höher als die äußere Umgebung – haben wir unsere Untersuchungen bei pH 6,024,25,26 durchgeführt. Dadurch wird auch sichergestellt, dass unsere Ergebnisse mit früheren mikrobiologischen und biochemischen Arbeiten an NSC 60339 übereinstimmen, die bei pH 6,010,14,27 abgeschlossen wurden. Folglich wurden unsere HDX-Markierungszeiten geändert, um typische Markierungszeiten bei physiologischem pH-Wert genau darzustellen (siehe Methoden), da der pH-Wert die Austauschraten von HDX beeinflusst.

Um die Strukturdynamik von AcrA zu verstehen, haben wir unsere Probe für die Untersuchung mit HDX-MS optimiert, das Informationen auf molekularer Ebene zur Proteinkonformation und -dynamik liefert28. HDX tritt auf, wenn Amidwasserstoffe auf dem Peptidrückgrat für deuterierten Puffer zugänglich werden und einen Isotopenaustausch mit D2O eingehen. Die Zugänglichkeit ergibt sich aus der strukturellen Entfaltung und dem Aufbrechen von Wasserstoffbrückenbindungen. Daher zeigen unstrukturierte Regionen einen schnellen Austausch, wenn sie Lösungsmittel ausgesetzt werden, während Regionen mit stabilen Sekundärstrukturen einen langsameren Austausch zeigen, da diese Regionen durch Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke geschützt und stabilisiert werden. Um eine zuverlässige Interpretation der Wirkung von Inhibitor- und Substratwechselwirkungen auf die AcrA-Dynamik zu ermöglichen, haben wir Konstrukte untersucht, die die Probenhomogenität gewährleisten würden (Abb. 1c). Wir haben die oligomere Homogenität mittels nMS überwacht, was den Transfer intakter Proteine ​​in die Gasphase unter Beibehaltung nichtkovalenter Wechselwirkungen ermöglicht und daher in der Lage ist, über oligomere Proteinzustände zu berichten29,30.

Wir haben zunächst AcrA gereinigt, das sein Signalpeptid (Reste 1–24) enthält, das nach der Lipidierung an Cys25 (AcrAL) gespalten wird (Abb. 1c)27. Dieses Konstrukt ist mit der Membran verbunden und wurde daher in n-Dodecyl-β-d-maltopyranosid (DDM)-Detergensmizellen aus der Membran gereinigt. NMS ergab, dass AcrAL als Gemisch aus Monomeren und Dimeren bei pH 6,0 vorlag (Abb. 1d); Bei einem pH-Wert von 7, 4 wies AcrAL eine erhöhte Heterogenität auf und bildete Monomere bis hin zu Pentameren (ergänzende Abbildung 1). Dieser Grad an Heterogenität würde die HDX-MS-Interpretation erschweren. Daher gingen wir davon aus, dass AcrA keine Lipidierung aufweist (AcrAS), von dem zuvor gezeigt wurde, dass es seine Funktionalität beibehält und das in mehreren anderen Studien verwendet wurde16, 17, 18, 27. AcrAS fehlt sein Signalpeptid (Reste 1–24) und sein Cys25 wurde durch ein Ausgangsmethionin (Met25) ersetzt. Es wird vom Zytosol exprimiert und gereinigt und weist an seinem N-Terminus keine Lipidierung auf. NMS-Studien von AcrAS ergaben, dass es sowohl bei pH 7,4 als auch bei pH 6,0 vollständig monomer war (Abb. 1d und ergänzende Abb. 1). Daher haben wir uns entschieden, für unsere Untersuchungen bei pH 6,0 mit dem AcrAS-Konstrukt fortzufahren.

Da AcrA im zusammengesetzten Komplex ein Trimer von Dimeren bildet, haben wir auch ein AcrA-Pseudo-Dimer-Konstrukt (AcrASD) untersucht (Abb. 1c). Dies wird es uns ermöglichen, die Auswirkung der Dimerisierung auf die Strukturdynamik von AcrA zu untersuchen und zu untersuchen, wie die NSC 60339-Hemmung durch das Vorhandensein einer Dimerschnittstelle beeinflusst wird. Das Konstrukt enthielt zwei AcrAS-Sequenzen, die durch einen Linker aus fünf Aminosäuren verbunden waren, und nMS bestätigte, dass es sich bei pH 6,0 um ein homogenes Pseudodimer handelte (Abb. 1d).

Abgesehen von der Aufklärung der Stöchiometrie können Ladungszustandsverteilungen (CSDs), die in nMS-Spektren beobachtet werden, Aufschluss über Konformationseigenschaften geben31,32. Interessanterweise deuten unsere nMS-Spektren darauf hin, dass AcrA in allen Konstrukten Bereiche mit intrinsischer Störung enthalten könnte. NMS-Spektren aller drei Konstrukte weisen mindestens zwei CSDs auf, was Populationen gefalteter und unstrukturierterer Konformere widerspiegelt, die während der Proteinionisierung in die Gasphase auftreten (Abb. 1d und ergänzende Abb. 1). Es wurde festgestellt, dass gemischte CSDs wie diese eine Diagnose für gefaltete Proteine ​​sind, die Bereiche mit intrinsischer Störung enthalten33. Bei diesem Bereich handelt es sich wahrscheinlich, wie zuvor postuliert, um die MP-Domäne, da er in Kristallstrukturen häufig nicht aufgelöst ist18,34.

Als nächstes verwendeten wir HDX-MS, um die intrinsische Dynamik unserer AcrA-Konstrukte zu bewerten. Nach der Optimierung des Abschreckens und Aufschlusses auf AcrAS (siehe „Methoden“ und ergänzende Abbildung 2) konnten wir für unsere HDX-MS-Untersuchungen eine Sequenzabdeckung von > 95 % erreichen. Eine relative fraktionierte Deuteriumaufnahmeanalyse von AcrAS zeigt Bereiche mit zeitabhängigem Austausch, die für ein gefaltetes Protein mit Unterschieden in der Sekundärstruktur und -dynamik charakteristisch sind (ergänzende Abbildung 3). Die α-Helices weisen über den gesamten HDX-Zeitverlauf ein starkes Schutzniveau auf, was darauf hindeutet, dass dies der strukturell stabilste Bereich von AcrA ist. Allerdings zeigten Peptide in Bereichen der MP- (Reste 25–42, 375–380) und der αβ-Barrel-Domänen (Rest 264–275) bereits zu den frühesten Zeitpunkten (10 s) einen nahezu maximalen Deuteriumeinbau, was auf Unstrukturierung hinweist Regionen35. Dies unterstützt weiter, dass die MP-Domäne vorwiegend Bereiche mit intrinsischer Störung enthält. Um diese Vorstellung weiter zu erweitern, haben wir die Struktur von AcrA bewertet, wie von AlphaFold2 (ergänzende Abbildung 4) 36, 37 vorhergesagt. AlphaFold2 bietet einen Konfidenzwert pro Rest (pLDDT) zwischen 0 und 100 für jeden Rest; Regionen mit einem Wert von < 50 können unstrukturiert sein. Die Regionen 1–36 und 379–397 liegen beide in der MP-Domäne und enthalten viele Reste mit einem pLDDT-Score < 50. Dies steht im Einklang mit unseren Massenspektrometrieergebnissen, dass die MP-Domäne unstrukturierte Regionen enthält. Daher klassifizieren wir AcrA als gefaltetes Protein mit Bereichen intrinsischer Unordnung. Dies kommt AcrA wahrscheinlich funktionell als PAP zugute, da das Periplasma eine dynamische Umgebung ist, deren Größe sich unter verschiedenen Bedingungen ändern kann, und AcrA flexibel genug sein muss, um diese Änderungen zu berücksichtigen und einen versiegelten Kanal im zusammengebauten Komplex aufrechtzuerhalten38.

Um die Auswirkungen der NSC 60339-Hemmung auf AcrAS zu untersuchen, führten wir eine differenzielle HDX (ΔHDX) zwischen AcrAS + NSC 60339 und AcrAS allein durch. ΔHDX analysiert den Unterschied zwischen zwei Zuständen und ist ein empfindlicher Ansatz zur Charakterisierung und Lokalisierung der Auswirkung eines Zustands auf die Strukturdynamik eines Proteins39. Für ein bestimmtes Peptid berechnen wir die Menge an Deuterium, die in jedem Proteinzustand eingebaut ist (kein Medikament/NSC 60339/Novobiocin), indem wir das Schwerpunkt-m/z für einen bestimmten Zeitpunkt mit einer nicht deuterierten Referenzprobe vergleichen. In Abb. 2a können wir sehen, dass für ein repräsentatives Peptid (Reste 308–323) nach 1 Minute die Menge an eingebautem Deuterium für AcrAS ohne Arzneimittel und mit Novobiocin gleich ist, in Gegenwart von NSC 60339 jedoch > 1 Da Verringerung der Deuteriumaufnahme.

a Das m/z-Spektrum für Peptid 308-323 unter nicht-deuterierenden Bedingungen und deuterierenden Bedingungen mit DMSO, NSC 60339 und Novobiocin. Der Schwerpunkt wird durch die gepunktete Linie dargestellt und die Massenänderung der deuterierten Proben wird in Dalton angegeben. b Chiclet-Diagramm, das die Differential-HDX-Diagramme (ΔHDX) für AcrAS +/− NSC 60339 für alle erfassten Zeitpunkte anzeigt. Blau kennzeichnet Gebiete mit verringertem HDX zwischen den Bundesstaaten. Wir definierten die Signifikanz als ± ≥ 0,33 Da-Änderung (siehe „Methoden“ und ergänzende Abbildung 9) mit einem P-Wert ≤ 0,01 in einem zweiseitigen Welch-t-Test (8 unabhängige Messungen: nbiologisch = 2 und ntechnisch = 4). Weiße Bereiche stellen Regionen mit unbedeutendem ΔHDX dar. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. c ΔHDX für ((AcrAS + NSC 60339) – AcrAS) für den letzten Zeitpunkt wird mit HDeXplosion und Chimera auf die AcrA-Struktur (PDB:5O66) gemalt23,55,56. Dargestellt ist der vergrößerte Ausschnitt der Stelle IV, wobei die Seitenketten der beteiligten Reste hervorgehoben sind14. d Aufnahmediagramme für drei Peptide in verschiedenen Domänen von AcrA. Die Aufnahmediagramme zeigen die durchschnittliche Deuteriumaufnahme und Fehlerbalken geben die Standardabweichung an (8 unabhängige Messungen: nbiologisch = 2 und ntechnisch = 4).

In Gegenwart von NSC 60339 zeigte AcrAS eine Stabilisierung über alle vier Domänen hinweg (Abb. 2b, c), wobei die Region der Stelle IV durch Computermodellierung und Trp-Fluoreszenzspektroskopie als mögliche Bindungsstelle innerhalb einer Spalte zwischen Lipoyl- und αβ-Barrel-Domänen identifiziert wurde – betroffen sein (Abb. 2c und 3a, b). Teile der Stelle IV zeigten in Gegenwart von NSC 60339 eine signifikante Abnahme der Deuteriumaufnahme (Abb. 2b – d), wobei Peptide einschließlich der Reste F81 und F254 eine verminderte Aufnahme zeigten. Die Reste F81 (Lipoyldomäne) und F254 (αβ-Fassdomäne) sind beide an der Bindung von NSC 60339 beteiligt, wobei F81 auch für die Effluxfunktion essentiell ist. Die HDX-Reduzierung in diesen Bereichen kann auf eine Arzneimittelbindung zurückzuführen sein, die den lokalen Bereich durch direkte Wechselwirkungen mit Amidwasserstoffen stabilisiert, oder auf eine Verringerung der Lösungsmittelzugänglichkeit innerhalb der beteiligten Domänen. Basierend auf der angedockten Struktur (Abb. 3a) klammern sich F81 und F254 an die Stelle IV, haben jedoch keinen direkten Kontakt mit NSC 60339. In MD-Simulationen zeigt F254 jedoch geringere Schwankungen (Abb. 3d) und sowohl F81 als auch F254 zeigen reduziertes Lösungsmittel -zugängliche Oberfläche (SASA; ergänzende Abbildung 5), die zeigt, wie die Bindung von NSC 60339 allosterische Auswirkungen auf verschiedene Regionen von AcrA haben kann. Unsere HDX-MS- und MD-Daten unterstützen zusammen mit den vorherigen Arbeiten, dass Stelle IV die Bindungsstelle von NSC 60339 ist.

eine angedockte Struktur von NSC 60339 (Mitte) an AcrA von Darzynkiewicz et al.14. F81 und F254 werden jeweils oberhalb und unterhalb von NSC 60339 angezeigt. b Vergrößerte Ansicht des NSC 60339-Bindungstaschenspalts. AcrA wird in einer Oberflächendarstellung dargestellt. c NSC 60339-Struktur; Die berechneten pKa-Werte für die Dihydroimidazolingruppen liegen bei > 9, was darauf hindeutet, dass es bei pH 6,068 dikationisch ist. d AcrA gefärbt entsprechend der Differenz der quadratischen Mittelfluktuationen (RMSF) zwischen Simulationen der gebundenen und Apo-Zustände, jeweils gemittelt über vier Replikate. Rot zeigt an, dass der RMSF im gebundenen Zustand größer ist, während Blau anzeigt, dass er im Apo-Zustand größer ist (der Farbbereich reicht von –2 Å, blau, bis 2 Å, rot, wie durch den Farbbalken angezeigt). RMSF wurde über die letzten 70 ns jeder 100-ns-Simulation berechnet.

Abgesehen von der Stelle IV zeigen unsere HDX-Ergebnisse, dass NSC 60339 eine weitreichende Stabilisierung der AcrA-Strukturdynamik abseits der NSC 60339-Bindungsstelle induziert. Die α-helikalen Haarnadeln zeigen eine Stabilisierung auf beiden Helices und dem flexiblen Linker, vor allem zu späteren Zeitpunkten. Dies ist wahrscheinlich auf die Stabilisierung der Lipoyldomäne durch NSC 60339 zurückzuführen, die die Fähigkeit von AcrA einschränkt, die Helices frei zu positionieren, was möglicherweise seine Konformationsplastizität verringert. Darüber hinaus weist die MP-Domäne in Gegenwart von NSC 60339 einen umfassenden Schutz auf. Der größte Schutzgrad in der MP-Domäne tritt zwischen den Resten 308–324 auf, wobei mehrere Peptide in dieser Region über den gesamten HDX-Zeitverlauf einen anhaltenden Schutz zeigen (Abb. 2b, c). Unsere Ergebnisse belegen, dass die in diesen Domänen beobachteten Effekte eher ein Downstream-Effekt von NSC 60339 als sekundäre Bindungsstellen sind. Root Mean Square Fluctuations (RMSF) aus unseren MD-Simulationen der gebundenen und Apo-Zustände zeigen einen hohen Grad an Stabilisierung der Reste 308–324, selbst im Vergleich zu anderen Resten (Abb. 3d und ergänzende Abb. 6), was unsere HDX-Daten unterstützt und bereitstellt Vertrauen, dass NSC 60339 eine weitreichende Stabilisierung der Dynamik abseits der vorgeschlagenen Bindungsstelle bewirken kann. Es wurde auch gezeigt, dass AcrA, dem die MP-Domäne fehlt, immer noch an NSC 60339 gebunden ist, was darauf hindeutet, dass seine Stabilisierung allosterisch auf die Bindung von NSC 60339 an Stelle IV14 zurückzuführen ist. Im Gegensatz zur MP-Domäne war der Unterschied im RMSF für die Lipoyldomäne gering (Abb. 3d und ergänzende Abb. 6); Teile der Lipoyldomäne zeigten jedoch eine verringerte SASA, was möglicherweise den durch HDX-MS beobachteten erhöhten Schutz erklärt (ergänzende Abbildung 5). Interessanterweise zeigten einige Bereiche der MP-, Lipoyl- und αβ-Barrel-Domänen in den MD-Simulationen eine erhöhte SASA, zeigten jedoch eine verringerte RMSF oder HDX (ergänzende Abbildung 5). Diese Beobachtung stützt, dass selbst bei erhöhter Lösungsmittelzugänglichkeit der verbesserte Schutz des Rückgratamids gegenüber HDX in diesen Regionen wahrscheinlich durch seine eingeschränkte Strukturdynamik dominiert wird.

Als Kontrolle und Vergleich mit NSC 60339 untersuchten wir die Wirkung von Novobiocin auf die AcrAS-Dynamik. Novobiocin ist ein Substrat von AcrAB-TolC, bindet an AcrA und wird dennoch nicht als EPI10 klassifiziert. Nach wie vor führten wir differentielles HDX mit AcrAS + Novobiocin und AcrAS allein durch (Abb. 2d und ergänzende Abb. 7). Unsere Ergebnisse zeigen, dass Novobiocin in unseren HDX-Experimenten kaum einen beobachteten Einfluss auf die Strukturdynamik von AcrA hat, was im krassen Gegensatz zu NSC 60339 steht. Die Peptidaufnahmediagramme in Abb. 2d zeigen drei Peptide über drei Domänen hinweg, die bei Hemmung durch NSC einen statistisch signifikanten Schutz zeigen 60339 (blaues Diagramm). Das schwarze Diagramm stellt die Aufnahme eines Peptids in Gegenwart von Novobiocin dar, und das grüne Diagramm stellt AcrAS allein dar. Wie die Aufnahmediagramme zeigen, gibt es keinen Unterschied beim Deuteriumeinbau zwischen AcrAS allein und mit Novobiocin, obwohl der Prozentsatz des Protein-Ligand-Komplexes gleich war (siehe Methoden). Als unterstützendes Experiment überwachten wir die Bindung von Novobiocin an AcrAS mithilfe von nMS (Ergänzungsabbildung 8 und Ergänzungstabelle 2) und beobachteten den Protein:Ligand-Komplex. Insgesamt stellen wir fest, dass Novobiocin, obwohl es ein Substrat von AcrA ist, keine globalen Auswirkungen auf die Strukturdynamik wie NSC 60339 hat (ergänzende Abbildung 9). Dies stützt unsere Annahme, dass NSC 60339 aufgrund seiner Fähigkeit, AcrA über alle vier seiner Domänen hinweg zu stabilisieren, ein erfolgreicher Inhibitor von AcrA ist. AcrA ist auf seine Dynamik und Flexibilität angewiesen, um als PAP19 zu fungieren. Daher könnte die Einschränkung dieser Konformationsfähigkeit ein vielversprechendes Ziel für die Hemmung im Allgemeinen sein.

Um die Auswirkung der Dimerisierung auf die Strukturdynamik von AcrA zu charakterisieren, führten wir eine differenzielle HDX zwischen Monomer und Dimer durch (ergänzende Abbildung 10). Bei AcrASD kam es im Vergleich zu AcrAS zu Bereichen mit verringertem HDX und damit zu einer Stabilisierung in allen vier Bereichen. Der Bereich, der den größten Rückgang von ΔHDX aufwies, waren die α-helikalen Haarnadeln zum letzten Zeitpunkt (10 Minuten). Dieser Schutz könnte durch die komplementäre Packung der α-helikalen Haarnadeln im Dimer erklärt werden, die zu einer Stabilisierung seiner Struktur und einem möglichen Lösungsmittelausschluss in der Bindungsschnittstelle führt40. Die MP-Domäne zeigte auch zu späteren Zeitpunkten Schutz zwischen den Resten 306–342 und dem αβ-Fass (Reste 261–288) in den frühen Zeitpunkten (10–60 s), was darauf hindeutet, dass die Dimerisierung diesen Regionen auch mehr strukturelle Ordnung verleihen könnte.

Unsere HDX-MS-Untersuchung zeigt, dass das AcrASD im Vergleich zum Monomer eine einzigartige Dynamik aufweist, obwohl es eine ähnliche thermische Stabilität wie das AcrAS-Konstrukt besitzt, gemessen am Zirkulardichroismus (CD, ergänzende Abbildung 11). Dies könnte bei seiner Assoziation in einem Komplex mit AcrB hilfreich sein. Um dies zu testen, verglichen wir die Bindung von AcrAS und AcrASD an AcrB in SMALP-Nanoscheiben (Styrol-Maleinsäure-Lipid-Partikel) mithilfe von SMA-PAGE, einer nativen PAGE-Methode, die für die Verwendung mit SMALPs angepasst ist (ergänzende Abbildung 12)41,42 . Es liefert stöchiometrische Informationen und kann die Bildung von Proteinkomplexen aufdecken. AcrAS scheint trimere AcrB-SMALPs in einem 1:1-Modell zu binden, wie bereits berichtet, AcrASD scheint jedoch trimeres AcrB in einer Reihe verschiedener Stöchiometrien zu binden, die durch SMA-PAGE-Analyse nicht aufgelöst wurden, was darauf hindeutet, dass Dimerisierung die AcrA-Wechselwirkung höherer Ordnung fördert (s) mit trimerem AcrB, eingebettet in eine Lipidumgebung27.

Um AcrASD-Wechselwirkungen mit NSC 60339 zu charakterisieren, verwendeten wir einen Oberflächenplasmonresonanz-Bindungstest (SPR). Zu diesem Zweck wurden AcrAS und AcrASD mit ähnlichen Dichten von 4743 bzw. 4054 Reaktionseinheiten (RU) auf einem Chip immobilisiert und steigende Konzentrationen von NSC 60339 von 6 μM auf 200 μM über die immobilisierten Proteine ​​injiziert. Dies war eine wirksame Möglichkeit, eine ähnliche Bindung von NSC 60339 an die beiden AcrA-Varianten qualitativ zu bestätigen, was darauf hindeutet, dass die Pseudodimerisierung die Art der Wechselwirkung von NSC 60339 mit der AcrA-Bindungsstelle nicht beeinflusst (ergänzende Abbildung 11).

Um zu untersuchen, ob die AcrA-Dimerisierung einen Einfluss auf die NSC 60339-Hemmung hat, wiederholten wir unsere differentiellen HDX-Experimente mit dem AcrASD-Konstrukt (Abb. 1c). Unsere Ergebnisse zeigen, dass NSC 60339 auf ähnliche Weise wirkt, wenn AcrA ein Dimer ist (Abb. 4a). Es besteht ein statistisch signifikanter Schutz in allen vier Domänen, wie er bei AcrAS beobachtet wurde, mit ausgeprägtem HDX-Schutz in der gesamten Lipoyldomäne, wo sich Stelle IV befindet, was darauf hindeutet, dass das Medikament in einem ähnlichen Bereich wirkt. Darüber hinaus weist AcrASD einen umfassenden Schutz in der MP-Domäne auf, wobei der Kern dieser Stabilisierung in derselben Region stattfindet (Reste 306–324). Auch in der α-helikalen Haarnadel findet eine Stabilisierung über die α2-Helix statt; jedoch weniger Peptide und eine kleinere Region im Vergleich zu AcrAS. Eine Möglichkeit hierfür könnte darin liegen, dass die Packung der Haarnadeln im Dimer die Region im Vergleich zum Monomer bereits stabiler macht (ergänzende Abbildung 10). Daher werden die Haarnadeln möglicherweise weniger durch die Hemmung von NSC 60339 im Dimer beeinflusst.

ein Chiclet-Diagramm, das die Differential-HDX-Diagramme (ΔHDX) für AcrASD +/− NSC 60339 für alle erfassten Zeitpunkte anzeigt. Blau kennzeichnet Gebiete mit verringertem HDX zwischen den Bundesstaaten. Wir definierten die Signifikanz als eine Änderung von ± ≥ 0,35 Da (siehe „Methoden“) mit einem P-Wert ≤ 0,01 in einem zweiseitigen Welch-t-Test (7 unabhängige Messungen: nbiologisch = 2 und ntechnisch = 3–4). Weiße Bereiche stellen Regionen mit unbedeutendem ΔHDX dar. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. b ΔHDX für ((AcrASD + NSC 60339) – AcrASD) für den 10-Minuten-Zeitpunkt wird mit HDeXplosion und Chimera auf die AcrA-Struktur (PDB:5O66) gemalt23,55,56. c Simuliertes AcrASD, gefärbt entsprechend der Differenz im RMSF über die letzten 70 ns von 100-ns-Simulationen der gebundenen und Apo-Zustände, jeweils gemittelt über vier Replikate. Blau zeigt an, dass der RMSF im Apo-Zustand größer ist als im gebundenen Zustand, während Weiß anzeigt, dass sie in beiden Zuständen ähnlich sind (der Farbbereich reicht von –2 Å, blau, bis 0 Å, weiß).

Interessanterweise sehen wir, dass auf der anderen Seite der Stelle IV ein reduzierter Bereich der αβ-Barrel-Domäne stabilisiert wird. Wenn AcrASD mit NSC 60339 gehemmt wird, zeigen nur die Reste 232–246 und 249–261 einen signifikanten Schutz, wohingegen AcrAS einen Schutz zwischen den Resten 228–260 und 52–62 zeigt, was auf einen Unterschied in der Art und Weise hinweisen könnte, wie das Arzneimittel innerhalb der Bindungsstelle interagiert .

Insgesamt scheint NSC 60339 AcrASD auf ähnliche Weise zu hemmen, indem es die Strukturdynamik von AcrA im gesamten Protein verringert. Um diese Hypothese zu untermauern, haben wir auch Simulationen der gebundenen und Apo-Zustände eines modellierten AcrASD ausgehend von einer vorhandenen Kristallstruktur (PDB 2F1M) durchgeführt18. Bei den meisten Kopien des Proteins wurde im Vergleich zum Apo-Zustand eine deutliche Verringerung des RMSF für den gebundenen Zustand beobachtet (Abb. 4c und ergänzende Abb. 13).

Wie zuvor untersuchten wir auch die Wirkung von Novobiocin auf AcrASD. Novobiocin schien kaum Einfluss auf die Strukturdynamik von AcrASD zu haben, was mit unseren Ergebnissen für AcrAS übereinstimmt (ergänzende Abbildung 14). Wie bei AcrAS konnten wir den Protein:Ligand-Komplex während der nMS erfassen (Ergänzungsabbildung 8 und Ergänzungstabelle 2).

Um festzustellen, ob das Targeting der flexiblen Gelenkregionen von AcrA zu einer Hemmung des Antibiotika-Effluxes durch AcrAB-TolC in vivo führen könnte, entwickelten wir als nächstes einen kovalenten Efflux-Hemmungstest unter Verwendung lebender E. coli-Zellen. Zu diesem Zweck konstruierten wir das Plasmid acrAB mit acrA-Varianten, die einzigartige Cys-Substitutionen in den flexiblen Linkern zwischen dem MP und dem αβ-Fass (Leu50Cys, Ile52Cys, Arg225 Cys, Glu229Cys, Asn232Cys) und zwischen dem αβ-Fass und den Lipoyldomänen (Arg183Cys, Thr205Cys, Asp284Cys) (Abb. 5c). Zellen, die die Varianten WT und AcrA(Cys)B produzieren, wurden mit einer Cys-reaktiven Sonde MTS-Rhodamin 6G (MTS-R6G) behandelt. Diese Sonde ist ein Substrat von AcrAB-TolC und ihre kovalente Bindung an Cys-Reste von AcrA, die sich an Positionen befinden, die für die Konformationsflexibilität und/oder Funktion des Proteins wichtig sind, dürfte die Effluxaktivität der AcrAB-TolC-Pumpe hemmen. In diesem Assay verwendeten wir hyperporinierte E. coli Δ9-Pore-Zellen, denen alle neun TolC-abhängigen Transporter fehlten und die die Plasmid-basierten AcrA(Cys)AcrB-Varianten trugen43. Die Hyperporinierung des OM hat die Permeabilitätsbarriere des OM beseitigt und das Eindringen von MTS in das Periplasma erleichtert, um AcrA(Cys) zu erreichen. Die Zellen wurden mit MTS vorbehandelt, die nicht reagierte Sonde wurde abgewaschen und die Kinetik des Ausflusses eines fluoreszierenden Substrats Hoechst 33342 (Hoechst) wurde analysiert.

ein experimentelles Verfahren zum Test der kovalenten Effluxhemmung. MTS-R6G ist die Cys-reaktive Sonde und Hoechst 33342 ist das fluoreszierende Effluxsubstrat. b E. coli Δ9-Pore-Zellen, die den AcrAB-TolC-Komplex mit den angegebenen AcrA-Varianten produzieren, wurden in zwei Aliquots aufgeteilt und einer der Aliquots wurde mit einer Cys-reaktiven Sonde MTS behandelt. Nach 15-minütiger Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen gewaschen und die intrazelluläre Akkumulation von Hoechst wie zuvor beschrieben analysiert61. Kinetische Daten wurden in eine Burst-Single-Exponential-Decay-Funktion eingepasst und die berechneten Anfangsraten der Hoechst-Akkumulation (μM/s) werden als Funktion der extern hinzugefügten Konzentration von Hoechst61 aufgetragen. Die Diagramme stellen den Mittelwert dar, und die Fehlerbalken geben die Standardabweichung (n = 3) aus unabhängigen Messungen an. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. c AcrA-Struktur (PDB 5O66) mit hervorgehobenen mutierten Resten23. Blaue Rückstände haben keinen Einfluss auf den Ausfluss und orange Rückstände hatten einen Effekt.

Wir fanden heraus, dass die MTS-R6G-Vorbehandlung von Zellen, die Wildtyp-AcrAB-TolC produzieren oder einen leeren Vektor tragen, keinen Einfluss auf die Hoechst-Akkumulation hatte, was darauf hindeutet, dass die beiden intrinsischen Cys-Reste von AcrB, die sich in der Transmembrandomäne des Proteins befinden, keinen Einfluss auf die Hoechst-Akkumulation haben Ergebnis des Tests (Abb. 5b). Als nächstes verglichen wir die Hoechst-Akkumulationsniveaus in den Zellen, die verschiedene AcrA(Cys)-Varianten produzierten, und zwar mit und ohne Vorbehandlung mit MTS-R6G. Alle mit AcrA(Cys)-Varianten zusammengebauten Pumpen waren im Hoechst-Ausfluss genauso effizient wie die Wildtyp-Pumpe, was mit ihrer Fähigkeit übereinstimmt, Δ9-Pore-Zellen vor Novobiocin, Erythromycin und SDS zu schützen (Ergänzungstabelle 3). Die Ausnahme bildet AcrA (Leu50Cys), das bei der MHK-Messung voll funktionsfähig zu sein schien (Ergänzungstabelle 3), beim Hoechst-Ausfluss jedoch nur teilweise wirksam war (Abb. 5b).

Die Vorbehandlung mit MTS-R6G hemmte nur die Aktivität der AcrA Leu50Cys-, Thr205Cys- und Asn232Cys-Varianten, wohingegen bei anderen analysierten AcrA(Cys)-Varianten keine signifikante Hemmung beobachtet wurde (Abb. 5b und ergänzende Abb. 15). Daher sind nur diese Cys-Reste von AcrA anfällig für die Bindung und Hemmung von MTS-R6G, wohingegen andere Cys-Reste im AcrAB-TolC-Komplex entweder nicht zugänglich sind oder die Bindung von MTS an diesen Stellen die Funktion des Komplexes nicht beeinträchtigt. Keiner dieser Reste ist an den charakterisierten AcrA:AcrB-Bindungsstellen beteiligt, sodass die hemmende Wirkung auf den Efflux nicht auf gestörte Wechselwirkungen beim Zusammenbau von AcrAB-TolC44 zurückzuführen ist. Eine Möglichkeit für diesen Hemmeffekt besteht darin, dass die MTS-Bindung zu einer Verringerung der Konformationsflexibilität von AcrA führt. Eindeutige Schlussfolgerungen zur eingeschränkten Dynamik können hier jedoch nicht gezogen werden. Die Ergebnisse zeigen jedoch, dass diese drei Stellen innerhalb der flexiblen Scharniere zwischen AcrA-Domänen für den Ausfluss der AcrAB-TolC-Pumpe entscheidend sind.

T205 befindet sich an Stelle IV, der vorgeschlagenen Bindungsstelle von NSC 60339, und ein weiterer Beweis dafür, dass es sich bei diesem Bereich um eine mit Medikamenten behandelbare Stelle für die AcrA-Hemmung handelt. Interessanterweise waren zwei weitere Reste an Stelle IV mutiert, hatten jedoch keinen Einfluss auf den Efflux (R183 und D284). Diese Reste befinden sich an der Peripherie von Stelle IV (Abb. 5b) und sind wahrscheinlich weniger wichtig für die AcrA-Funktion als T205, das sich im Kern der Spalte befindet. Darüber hinaus zeigte T205 in Gegenwart von NSC 60339 in beiden AcrA-Konstrukten einen signifikanten Schutz, was seine Bedeutung für die AcrA-Flexibilität unterstreicht. Die beiden anderen Reste, die eine hemmende Wirkung auf den Efflux hatten, befinden sich entfernt von Stelle IV, am flexiblen Linker zwischen den αβ-Barrel-MP-Domänen. N232C und L50C befinden sich beide am unteren Rand dieser Region und sind in die gleiche Richtung ausgerichtet (Abb. 5c). Die anderen Rückstände, die keinen Einfluss auf den Efflux hatten, waren über N232 und L50 positioniert und in die entgegengesetzte Richtung ausgerichtet. Interessanterweise wurden beide Positionen in unseren HDX-MS-Experimenten auch in signifikant geschützten Peptiden in Gegenwart von NSC 60339 gefunden. Dieser Befund legt nahe, dass NSC 60339 diesen Bereich stromabwärts seiner Bindungsstelle stabilisiert. Daher stellt dies eine weitere medikamentöse Stelle auf AcrA für das zukünftige Design von EPIs dar.

Zusammenfassend stützen unsere Ergebnisse, dass NSC 60339 sich in der Spalte zwischen den Lipoyl- und αβ-Barrel-Domänen (Stelle IV) positioniert und eine weitreichende Einschränkung der Rückgratdynamik von AcrA in allen vier seiner Domänen verursacht. Dieses Verhalten wurde sowohl bei Monomer- als auch bei Pseudodimer-Konstrukten beobachtet. Wir schlagen vor, dass NSC 60339 als molekularer Keil in dieser Spalte fungiert und die Strukturdynamik von AcrA erheblich einschränkt, was Auswirkungen auf die Konformationsübergänge haben könnte, die während der funktionellen Rotation der AcrAB-TolC-Pumpe erforderlich sind (Abb. 6). Eine aktuelle Studie der zusammengebauten AcrAB-TolC-Effluxpumpe in situ bestätigt, dass eines der AcrA-Protomere im AcrA-Dimer an der inneren Membran verankert ist und mit AcrB interagiert, während es sich gleichzeitig ausdehnt, um mit der Peptidoglycanschicht und TolC45 zu interagieren. Es wird vermutet, dass die N-terminale Region des zweiten Protomers mit der AcrB-PC2-Subdomäne interagiert, die während des Rotationsmechanismus umfangreiche Konformationsänderungen durchläuft 23 . Diese Architektur könnte es AcrA ermöglichen, Konformationsänderungen in AcrB an TolC zu übermitteln, während es den Rotationsmechanismus durchläuft, was dazu führt, dass TolC in den „offenen“ Zustand übergeht. Daher kann die Hemmung von NSC 60339 dazu führen, dass AcrA seine Fähigkeit verliert, Veränderungen im gesamten Periplasma anzupassen und die für den Efflux erforderlichen Konformationsänderungen von AcrB an TolC zu übermitteln. Dies könnte sich auf verschiedene Weise auf die Pumpe auswirken; (1) Die Wechselwirkung von AcrA mit AcrB und TolC kann gestört werden, wenn AcrA steifer wird, (2) AcrA ist möglicherweise nicht in der Lage, einen versiegelten Kanal während der funktionellen Rotation aufrechtzuerhalten, und 3) TolC wird möglicherweise nicht so effizient „geöffnet“.

Unter normalen Bedingungen werden, während AcrB seine drei Zustände seines Rotationsmechanismus (L locker, T fest, O offen) durchläuft, die Konformationsübergangsinformationen über AcrA an TolC übertragen, wodurch sichergestellt wird, dass es sich im „offenen“ Zustand für den Ausfluss befindet. AcrA wird konformativ eingeschränkt, sobald NSC 60339 zwischen seinen Lipoyl- und αβ-Barrel-Domänen „keilt“, was seine Fähigkeit zur Übertragung der Konformationsbewegungen von AcrB verringert und anschließend die funktionelle Rotation und den Efflux hemmt. Schema basierend auf der In-situ-Struktur von Chen et al.45.

Neuere Arbeiten haben AcrA als Nekrosignal identifiziert15,16. Abgestorbene Zellen setzen AcrA frei, das sich an TolC in der Außenmembran lebender Zellen bindet, um ein Signal zu senden, das den Arzneimittelausfluss und die Expression anderer Pumpen erhöht. Es wurde gezeigt, dass NSC 60339 sowohl den Efflux als auch die Nekrosignalisierung in AcrA16 hemmen kann. Darüber hinaus hemmt Novobiocin zwar nicht den Efflux, da sein primäres Ziel in Bakterien die DNA-Gyrase ist, es kann aber auch die Nekrosignalisierung hemmen, wenn auch nicht im gleichen Ausmaß wie NSC 6033946. Es wird vorgeschlagen, dass AcrA über seine α-helikale Haarnadelkontaktierung mit TolC interagiert die TolC-Pore. Wir zeigen, dass eine globale Stabilisierung von AcrA durch NSC 60339 seine Fähigkeit zur Hemmung von Nekrosignalen erklären könnte, möglicherweise durch eine Verringerung seiner Fähigkeit, an TolC an der Außenseite von Zellen zu binden. Es wurde jedoch auch gezeigt, dass Novobiocin die Nekrosignalisierung in AcrA hemmt, und wir konnten keinen signifikanten Effekt seiner Bindung auf die Strukturdynamik von AcrA beobachten. Daher kann Novobiocin die Nekrosignalisierung auf andere Weise hemmen, oder die Strukturdynamik ist möglicherweise nur ein Teil der Nekrosignalisierungsfähigkeit von AcrA. Die Nekrosignalfunktion von AcrA wurde erst kürzlich entdeckt und daher sind weitere Untersuchungen zu den Mechanismen der Nekrosignalisierung erforderlich, um diese Fähigkeit zu verstehen und herauszufinden, wie sie am besten gehemmt werden kann, um die Entstehung bakterieller Multiresistenzen durch diesen Prozess zu bekämpfen.

Insgesamt schlagen wir in dieser Arbeit einen Wirkmechanismus für den AcrA-Inhibitor NSC 60339 vor. Dies stellt ein Modell für die gezielte Steuerung der AcrAB-TolC-Multidrug-Effluxpumpe dar und bietet eine Plattform zum Verständnis und zur Entwicklung der nächsten Generation von EPIs. Es wurde festgestellt, dass AcrA mit anderen PAPs in nicht verwandten Systemen austauschbar ist, was seine Flexibilität unterstreicht47. Daher ist die Aufklärung der strukturellen Dynamik von AcrA von entscheidender Bedeutung, um seine Rolle als flexibles PAP innerhalb einer Reihe zusammengesetzter Multidrug-Efflux-Komplexe zu verstehen. Allgemeiner zeigen wir, wie HDX-MS in Kombination mit MD-Simulationen, hochauflösenden Strukturinformationen und mikrobiologischen Tests verwendet werden kann, um diese Dynamik zu verstehen und die molekularen Mechanismen der Hemmung zu bestimmen, wie zuvor bei AcrB48 beobachtet.

AcrAS, dem die Signalpeptidreste 1–24 und die Lipidierungsstelle Cys25 fehlen, wurde in ein pET28a-Plasmid mit einem 6xHis- und LE-Linker kloniert (alle zum Klonen verwendeten Primer finden Sie in der Ergänzungstabelle 4)17,27. AcrAS wird wie zuvor berichtet aus der zytoplasmatischen Fraktion gereinigt17. Kurz gesagt, pET28a, das AcrAS enthielt, wurde in E. coli C43(DE3) ΔacrAB-Zellen transformiert. 7 ml einer Luria-Bertani (LB)-Übernachtkultur wurden zu 1 l vorgewärmter LB-Kultur (x6) mit 30 μg/ml Kanamycin gegeben und bei 37 °C gezüchtet, bis eine OD600 von 0,6 erreicht war. Die Kultur wurde mit 1 mM IPTG induziert und 3 Stunden lang bei 37 °C gezüchtet. Die Zellen wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 4200 × g geerntet und mit eiskalter Phosphatpuffersalzlösung (PBS) gewaschen.

Zellpellets wurden bei –20 °C eingefroren und dann aufgetaut und in Puffer A (50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 5 mM Imidazol, pH 7,4) resuspendiert und mit einem Proteaseinhibitor (Roche), 100 mM PMSF, ergänzt μl Benzonase, 5 mM β-ME und Lysozym. Die Zellsuspension wurde durch Ultraschallbehandlung mit einer Amplitude von 40,6 × 15 s mit Pausen von 90 s lysiert. Unlösliches Material wurde durch 30-minütige Zentrifugation bei 20.000 × g und 4 ° C entfernt. Die Membranen wurden 1 Stunde lang bei 4 ° C mit 200.000 × g pelletiert.

Der Überstand, der die zytosolische Fraktion enthielt, wurde gesammelt und durch einen 0,22-μm-Filter (Thermo Fisher Scientific) filtriert. Die Probe wurde auf eine 1-ml-HiTrap-Säule (GE Healthcare) geladen, die mit Puffer B (50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 10 % Glycerin, pH 7,4) äquilibriert war. Die Säule wurde mit 20 Säulenvolumina (CV) Puffer B, 10 CV Puffer B mit 50 mM Imidazol gewaschen und mit Puffer B, der 500 mM Imidazol enthielt, eluiert. AcrAS wurde direkt auf eine HiLoad 16/600 Superdex 200 pg Größenausschlusschromatographie (SEC)-Säule (GE Healthcare) geladen, die mit Puffer C (50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 7,4) äquilibriert war. Für die HiTrap- und SEC-Säule wurde eine Flussrate von 1 ml/min verwendet. Spitzenfraktionen von AcrAS wurden gepoolt und bei –80 °C schockgefroren. SDS-PAGE und nMS wurden zur Beurteilung der Reinheit verwendet und die Konzentration wurde über Nanodrop bestimmt.

AcrAL, das das AcrA in voller Länge enthält, wurde aus genomischer E. coli-DNA amplifiziert und unter Verwendung der Restriktionsenzyme NcoI und XhoI mit einem LE-Linker und 6xHis in ein pET28a-Plasmid kloniert. Zellexpression, Wachstum und Lyse waren die gleichen wie bei AcrAS.

Die Membranen wurden 1 Stunde lang bei 4 ° C mit 200.000 × g pelletiert. Membranpellets wurden in eiskaltem Puffer A, ergänzt mit 100 mM PMSF und einer Proteaseinhibitortablette, auf 40 mg/ml resuspendiert und mit einem Potter-Elvehjem-Teflonstößel und einem Glasröhrchen homogenisiert. AcrAL wurde aus homogenisierten Membranen mit 1 % (w/v) n-Dodecyl-β-D-maltosid (DDM)-Detergenz (Anatrace) bei 4 °C solubilisiert. Unlösliches Material wurde durch 30-minütige Zentrifugation bei 100.000 × g und 4 ° C entfernt. Die HiTrap- und SEC-Stufen sind die gleichen wie oben, außer dass die Puffer alle 0,03 % (w/v) DDM enthielten.

AcrASD, das ein AcrAS-Molekül mit einer Cys25Ala-Mutation, einen TRRIT-Linker und ein zweites AcrAS-Molekül enthält, dem die Reste 1–25 fehlen und das einen LE-Linker und 6xHis enthält, wurde unter Verwendung der Restriktionsenzyme NcoI und XhoI in ein pET21d+-Plasmid kloniert. Um das Screening potenziell positiver Ergebnisse zu erleichtern, wurde eine BamHI-Stelle in die Linkerregion eingebaut. Zellexpression, Wachstum und Reinigung waren identisch mit AcrAS, außer dass 100 μg/ml Ampicillin für das Zellwachstum verwendet wurden.

AcrB wurde wie zuvor berichtet exprimiert und gereinigt48. Kurz gesagt, das AcrB enthaltende pET15b-Plasmid wurde in E. coli C43(DE3) ΔacrAB-Zellen transformiert. 7 ml einer LB-Übernachtkultur wurden zu 1 l vorgewärmter LB-Kultur (×6) mit 100 μg/ml Ampicillin gegeben und bei 37 °C gezüchtet, bis eine OD600 von 0,6–0,8 erreicht war. Die Kultur wurde mit 1 mM IPTG induziert und 16–18 Stunden lang bei 18 °C gezüchtet. Die Zellen wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 4200 × g geerntet und mit eiskaltem PBS gewaschen.

Das Zellpellet wurde in Puffer A (50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4) resuspendiert und mit einem Proteaseinhibitor (Roche), 100 μM PMSF, 2 μl Benzonase und 5 mM β-ME ergänzt. Die Zellsuspension wurde zweimal durch einen Mikrofluidizer-Prozessor (Microfluidics) bei 25.000 psi und 4 °C geleitet. Unlösliches Material wurde durch 30-minütige Zentrifugation bei 20.000 × g und 4 ° C entfernt. Die Membranen wurden 1 Stunde lang bei 4 ° C (Thermo Fisher Scientific) mit 200.000 × g pelletiert. Membranpellets wurden in eiskaltem Puffer A, ergänzt mit 100 μM PMSF und einer Proteaseinhibitortablette, auf 40 mg/ml resuspendiert und mit einem Potter-Elvehjem-Teflonstößel und einem Glasröhrchen homogenisiert.

AcrB wurde aus den homogenisierten Membranen mit 2,5 % (w/v) SMA 2000-Copolymer 2 Stunden lang bei Raumtemperatur extrahiert, um native Nanoscheiben zu bilden. Unlösliches Material wurde durch 30-minütige Zentrifugation bei 100.000 × g und 4 ° C entfernt. Die Probe wurde mit 1 ml Super-Nickel-NTA-Agarose-Affinitätsharz (Generon), äquilibriert in Puffer B (50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 10 % Glycerin, pH 7,4), über Nacht bei 4 °C unter leichtem Rühren inkubiert. Die Probe wurde auf eine Schwerkraftflusssäule übertragen und mit 20 CV Puffer B, 10 CV Puffer B mit 50 mM Imidazol gewaschen und mit Puffer B, der 500 mM Imidazol enthielt, eluiert. Anschließend wurde AcrB mithilfe einer PD-10-Entsalzungssäule (GE Healthcare) gegen Puffer C (50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 7,4) gepuffert und bei –80 °C schockgefroren. Zur Beurteilung der Reinigung wurde SDS-PAGE verwendet und die Konzentration wurde über Nanodrop bestimmt.

Gereinigtes AcrAS, AcrASD und AcrAL wurden in eine flüchtige Lösung (100 mM Ammoniumacetat, pH 6,0/7,4) +/–0,03 % DDM unter Verwendung eines Zentrifugalaustauschgeräts (Micro Bio-Spin 6, Bio-Rad) gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgetauscht oder über eine SEC Superdex 10/200-Erhöhungssäule mit einer Flussrate von 0,4 ml/min. Experimente zur nativen Massenspektrometrie wurden mit einem Synapt G2-Si-Massenspektrometer (Waters) oder dem Q-Exactive Plus UHMR (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt.

Jede Probe wurde in selbstgemachte goldbeschichtete Borosilikatglaskapillaren geladen und auf einem Synapt G2-Si-Massenspektrometer (Waters) montiert, wo native Massenspektrometrieexperimente durchgeführt wurden. Es wurde eine Nano-Elektrospray-Ionisation (nESI) durchgeführt und die erzeugten Proteinionen wurden in das Vakuum des Massenspektrometers gezogen. Die folgenden Instrumentenparameter wurden sorgfältig optimiert, um Ionenaktivierung und Proteinentfaltung zu vermeiden: Kapillarspannung: 1,4 kV, Probenkegel: 30 V, Fallen-DC-Vorspannung: 15 V, Fallen-Kollisionsenergie: 2 V und Transfer-Kollisionsenergie: 2 V. Drücke wurden im Quellbereich (Backing) auf 5,91 × 10−2 mbar und in den Fallen- und Transferkollisionszellen auf 1,58 × 10−2 mbar eingestellt (Kollisionsgas: He).

Für AcrAL war eine höhere Energie erforderlich, um das Protein aus seiner hydrophoben Umgebung freizusetzen. Der Probenahmekegel wurde daher auf 120 V und die Kollisionsenergie der Falle auf 50–200 V eingestellt. Die anderen Instrumentenparameter wurden beibehalten.

Nur AcrAS/SD wurden mit dem Q-Exactive Plus UHMR (Thermo Fisher Scientific) gemessen. Bei Proben, die Novobiocin enthielten, wurde das Arzneimittel dem Protein zugesetzt und vor der MS-Analyse 30 Minuten lang inkubiert. Die verwendeten UHMR-Einstellungen waren: 1,5 kV Sprühspannung, Kapillartemperatur 60 °C, IST aus, Erweitertes Einfangen 60.

Die Daten wurden mit MassLynx v.4.1 (Waters) und UniDec (v.4.2.2)49 verarbeitet und analysiert.

NSC 60339 und Novobiocin wurden von MedChemExpress bzw. Caymen Chemical bezogen. Stammlösungen von NSC 60339 (10 mM) und Novobiocin (600 μM) wurden in 100 % DMSO hergestellt und 2–3 Stunden lang beschallt, um die Löslichkeit sicherzustellen. Die Erzielung eines maximalen Prozentsatzes an Protein:Wirkstoffkomplex während der Deuteriummarkierung ist ein wichtiger Gesichtspunkt für HDX-MS-Experimente. NSC 60339 und Novobiocin binden beide mit μM-Affinität an AcrAS (NSC 60339 mit einem KD von 78 μM und Novobiocin mit einem KD von 4,3 μM, gemessen durch frühere SPR-Messungen bei pH 6,0)10. Um sicherzustellen, dass in unseren Markierungsbedingungen ein maximaler Protein-Wirkstoff-Komplex vorhanden war, verwendeten wir die folgende Gleichung50:

Das Protein wurde mit 500 μM NSC 60339 oder 30 μM Novobiocin inkubiert, bevor es in Markierungspuffer verdünnt wurde, der die gleiche Wirkstoffkonzentration enthielt. 5 % DMSO wurden während des gesamten Experiments konstant gehalten, um die Löslichkeit des Arzneimittels sicherzustellen.

HDX-MS-Experimente wurden auf einem nanoAcquity Ultra-Performance Liquid Chromatography (UPLC) Xevo G2-XS QTof-Massenspektrometersystem (Waters) durchgeführt. Eine optimierte Peptididentifizierung und Peptidabdeckung für AcrAS/SD wurde anhand nicht deuterierter Kontrollen durchgeführt. Der optimale Probenworkflow für HDX-MS von AcrAS/SD war wie folgt: 5 μl AcrAS/SD (20 μM) wurden in 95 μl eines der Äquilibrierungspuffer (50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 5 % DMSO, +) verdünnt /−NSC 60339/Novobiocin, pH 6,0) oder Markierungspuffer (deuterierter Äquilibrierungspuffer) bei 20 °C. Nach festgelegten Zeiten der Deuteriummarkierung wurden die Proben mit 100 μl Quenchpuffer (Ameisensäure, 1,6 M GuHCl, 0,1 % Fos-Cholin, pH 1,9) gemischt, um eine gelöschte Probe bei pH 2,4 bereitzustellen. 70 μl der gequenchten Probe wurden dann auf eine 50 μl-Probenschleife geladen, bevor sie in 0,1 % Ameisensäure in Wasser (200 μl/min Durchflussrate) bei 20 °C auf eine Online-Enzymate™-Pepsin-Verdauungssäule (Waters) injiziert wurden. Die Magenfragmente wurden 3 Minuten lang auf einer Acquity BEH c18 1,7 μM VANGUARD-Vorsäule (Waters) gefangen. Die peptischen Fragmente wurden dann unter Verwendung eines 8–35 %-Gradienten von 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril (40 μl/min Flussrate) in eine gekühlte Acquity UPLC BEH C18 1,7 μM 1,0 × 100 mm-Säule (Waters) eluiert. Sowohl die Falle als auch die UPLC wurden bei 0 °C gehalten. Die eluierten Peptide wurden durch Elektrospray im Xevo G2-XS QTof-Massenspektrometer ionisiert. MSE-Daten wurden mit einer 20–30-V-Kollisionsenergierampe für die Falle erfasst, um Produktionen mit hoher Energie zu erfassen. Als Fallen-Kollisionsgas wurde Argon mit einer Flussrate von 2 ml/min verwendet. Leucin-Enkephalin wurde zur Korrektur der Lock-Mass-Genauigkeit verwendet und das Massenspektrometer wurde mit Natriumiodid kalibriert. Die Online-Enzymate™-Pepsin-Verdauungssäule (Waters) wurde dreimal mit Pepsin-Waschlösung (1,5 Gu-HCl, 4 % MeOH, 0,8 % Ameisensäure, 0,1 % Fos-Cholin) gewaschen und zwischen jeder Probe wurde ein Leerlauf mit Pepsin durchgeführt Waschen ohne Fos-Cholin, um eine signifikante Peptidübertragung zwischen den Läufen zu verhindern.

Alle Deuteriumzeitpunkte und Kontrollen wurden dreifach/vierfach durchgeführt. Die Sequenzidentifizierung wurde anhand von MSE-Daten verdauter undeuterierter Proben von AcrAS/SD unter Verwendung der Software ProteinLynx Global Server 3.0.2 (Waters) durchgeführt. Die Ausgabepeptide wurden dann mit DynamX (Version 3.0) unter Verwendung dieser Parameter gefiltert: Mindestintensität von 1481, minimale und maximale Peptidsequenzlänge von 5 bzw. 20, minimale MS/MS-Produkte von 1, minimale Produkte pro Aminosäure von 0,11, und eine maximale MH+-Fehlerschwelle von 5 ppm51. Alle Spektren wurden visuell untersucht und nur diejenigen mit einem geeigneten Signal-Rausch-Verhältnis wurden für die Analyse verwendet. Die Menge der relativen Deuteriumaufnahme für jedes Peptid wurde mit DynamX (Version 3.0) bestimmt und nicht um den Rückaustausch korrigiert, da nur relative Unterschiede für die Analyse und Interpretation verwendet wurden und die Normalisierung der Daten keinen Nutzen brachte52. Die einzige Ausnahme bildet die HDX-Heatmap von AcrAS, auf die eine Rückaustauschkorrektur angewendet wurde (ergänzende Abbildung 3). Die relative fraktionierte Aufnahme (RFU) wurde anhand der folgenden Gleichung berechnet, wobei Y die Deuteriumaufnahme für Peptid a zur Inkubationszeit t und D der Prozentsatz an Deuterium in der endgültigen Markierungslösung ist:

Für jeden Datensatz wurde basierend auf der Qualität der Daten, wie zuvor definiert, ein Signifikanzniveau-Cutoff festgelegt53,54. Konfidenzintervalle für differenzielle HDX-Messungen zu jedem einzelnen Zeitpunkt wurden gemäß einem zweiseitigen Welch-T-Test mit der HDeXplosion-Software55 bestimmt. Nur Peptide, die den entsprechenden ΔHDX-Grenzwert und ein Konfidenzintervall von 99 % erfüllten, wurden als signifikant angesehen. Alle ΔHDX-Strukturzahlen wurden aus den Daten mit HDeXplosion und Chimera55,56 generiert. Alle unterstützenden Daten und Metadaten werden in der Quelldatendatei gemeldet (Ergänzende Abbildungen 3, 7, 9, 10 und 14).

5 μl Protein (+/–5 % DMSO) wurden in 95 μl Markierungspuffer (+/–5 % DMSO) bei markiertem pH-Wert 6,0 für 251 Minuten bei 50 °C verdünnt. Dies folgt dem zuvor festgelegten Protokoll der Markierung für 10 Minuten bei pH 7,4 bei ~5 °C unter der Tm des Proteins57. Dadurch soll ein maximaler Deuteriumeinbau des ungefalteten Proteins gewährleistet werden. Der Deuteriumgehalt im Reaktionsgemisch ist identisch mit dem entsprechenden HDX-Experiment. Nach 251 Minuten wurden die Proteine ​​2 Minuten lang bei Raumtemperatur und dann 2 Minuten lang auf Eis belassen, bevor sie schockgefroren und bis zur LC-MS-Analyse bei –80 °C gelagert wurden.

Für die nativen SMA-PAGE-Gele wurden Novex Tris-Glycin-Gele (4–20 %) verwendet (Thermo Fisher Scientific). Alle nativen Gele wurden mit Tris-Glycin-Laufpuffer (25 mM Tris pH 8,8, 192 mM Glycin) betrieben. Der native Beladungsfarbstoff war Novex Tris-Glycine Native Sample Buffer (Thermo Fisher Scientific). SMA-PAGE-Gele wurden 90–120 Minuten lang bei 4 °C und 150 V betrieben. Um Protein nachzuweisen, wurden die Gele gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Quick Coomassie Stain (NeoBiotech) gefärbt.

AcrAS- und AcrASD-Protein wurden mithilfe der Aminkopplungsmethode immobilisiert. Zu diesem Zweck wurden Oberflächen des CM5-Chips (BiaCore) mit 0,05 M N-Hydroxysuccinimid und 0,2 M N-Ethyl-N-(3-diethylaminopropyl)carbodiimid aktiviert. AcrAS und AcrASD wurden unmittelbar nach der Aktivierung über Oberflächen injiziert. Nach der Immobilisierung wurde der Überschuss an reaktiven Gruppen durch Injektion von 0,5 M Ethanolamin-HCl (pH 8,0) blockiert. Die Immobilisierungs- und anschließenden Bindungsexperimente wurden in Laufpuffer durchgeführt, der 20 mM HEPES-KOH (pH 7,0), 150 mM NaCl und 0,03 % DDM, ergänzt mit 5 % DMSO, enthielt. Der CM5-Chip enthält vier Kammern, während die erste (Kontrolloberfläche) auf die gleiche Weise aktiviert und verarbeitet wurde, das Protein jedoch während des Immobilisierungsschritts weggelassen wurde. Die zweite und dritte Kammer enthielten das immobilisierte AcrAS und AcrASD (Ligand). Die immobilisierten Dichten beider Proteine ​​(Ligand) betrugen 4743 bzw. 4054 Antworteinheiten (RU). Die Sensorgramme wurden wie zuvor beschrieben gesammelt und analysiert58,59.

Alle Aminosäuresubstitutionen in acrA wurden mit dem QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit unter Verwendung von p151acrABHis als Matrize60 eingeführt. Das Primerdesign und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Reaktion für jede Substitution wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

Der Stamm E. coli Δ9-Pore (acrB ΔacrD ΔacrEF::spc ΔemrB ΔemrY ΔentS::cam ΔmacB ΔmdtC ΔmdtF attTn7::mini-Tn7T Tpr araC ParaBAD fhuAΔC/Δ4L) wurde zuvor konstruiert43. Dieser Stamm wurde in Antibiotika-Empfindlichkeits- und kovalenten Hemmungsstudien verwendet.

Die Anfälligkeiten der E. coli Δ9-Pore-Zellen, die Plasmid-basierte AcrA(Cys)AcrB-Varianten enthielten, gegenüber SDS, Novobiocin, Erythromycin und Vancomycin wurden durch zweifache Mikroverdünnung der Brühe bestimmt. Kurz gesagt, Übernachtkulturen wurden in LB-Brühe (Trypton, 10 g/l; Hefeextrakt, 5 g/l; NaCl, 5 g/l) subkultiviert und die Zellen wurden bei 37 °C in einem Schüttler bei 225 U/min gezüchtet bis OD600 reicht bis 0,2–0,3. Für die ordnungsgemäße Expression der Pore wurde jeder Kultur L-Arabinose (Endkonzentration 0,1 %) zugesetzt und die Zellen wurden weiter gezüchtet, bis die OD600 1,0 erreichte. Die minimale Hemmkonzentration jedes Bakterienstamms gegen verschiedene Antibiotika wurde in 96-Well-Platten gemessen. In jede Vertiefung wurden exponentiell wachsende Zellen gegeben und 18 Stunden lang inkubiert. Die Platten wurden gescannt, um die endgültige OD600 mit dem Mikroplattenlesegerät Spark 10M (TECAN) zu bestimmen.

Übernachtkultur von E. coli ∆9-Pore-Zellen, die das Plasmid p151-AcrABHis mit den angegebenen Substitutionen in AcrA tragen, wurden 6 Stunden lang mit 0,1 % Arabinose subkultiviert, um eine OD600 von 1,0 zu erreichen. Zur kovalenten Hemmung von AcrA wurden die Zellen in zwei Aliquots aufgeteilt und ein Aliquot mit 20 μM MTS 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Das Vergleichszell-Aliquot wurde mit einem Blindlösungsmittel (Dimethylsulfoxid) unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit HMG-Puffer (50 mM HEPES-KOH-Puffer pH 7,0, 1 mM Magnesiumsulfat und 0,4 mM Glucose) gewaschen und in HMG-Puffer bis zu einer OD600 von ~1,0 bei Raumtemperatur resuspendiert. Verschiedene Hoechst-Konzentrationen wurden getestet, um die Substratausflusseffizienz jeder mutierten Zelle zu messen, indem die Kinetik der Hoechst-Akkumulation bei λex = 350 nm und λem = 450 nm gemessen wurde. Die Daten wurden normalisiert und die kinetischen Parameter wurden wie zuvor beschrieben mit einem MATLAB-Programm61 berechnet. Kurz gesagt, die Zeitverläufe der Hoechst-Aufnahme (ergänzende Abbildung 13) wurden an die Burst-Single-Exponential-Decay-Funktion F = A1 + A2 ∙ (1−exp(−kt)) angepasst, wobei A1 und A2 die Größe des Fastens beschreiben und langsame Schritte, und k ist die Geschwindigkeit des langsamen Schritts. Die schnellen und langsamen Schritte wurden der Hoechst-Bindung an die Lipide (dh im Periplasma) bzw. chromosomale DNA (dh im Zytoplasma) zugeschrieben. Die anfänglichen Raten für die Hoechst-Akkumulation im Zytoplasma wurden als VI = A2 ∙ k berechnet und in Abb. 5b und der ergänzenden Abb. 15 dargestellt.

Alle CD-Spektren wurden in einem Aviv-Zirkulardichroismus-Spektrophotometer, Modell 410, gemessen. Eine endgültige Proteinkonzentration von 0,4/0,26 mg/ml wurde in einer rechteckigen zerlegbaren Suprasil-Quarzzelle mit einer Schichtdicke von 1,0 mm verwendet. Jede Probe wurde zweimal von 260 bis 190 nm in 1-nm-Intervallen mit einer Mittelungszeit von 0,5 s bei Temperaturen im Bereich von 25 bis 90 °C in Schritten von 5 °C gescannt. DMSO wurde bei 0,5 % gehalten. Auf SigmaPlot analysierte Spektren.

MD-Simulationen des NSC 60339-gebundenen Monomers wurden mit der angedockten Struktur von Darzynkiewicz et al.14 initialisiert, während die des Apo dieselbe Struktur mit entfernter Verbindung verwendeten. Jedes der beiden Systeme wurde in einer ~(170-Å)3 kubischen Wasserbox solvatisiert, um das Taumeln des Proteins ohne Verwendung von Orientierungsbeschränkungen zu ermöglichen, und mit 150 mM NaCl ionisiert, was zu einer Systemgröße von ~476.000 Atomen führte (Ergänzung). Abb. 16). Das Dimersystem wurde ausgehend von der AcrA-Dimerstruktur in PDB 2F1M18 konstruiert. Die MP-Domäne wurde basierend auf der Monomerstruktur hinzugefügt und die Reste in den Lipoyl- und αβ-Barrel-Domänen wurden angepasst, um ihren Positionen in der NSC 60339-gebundenen Struktur zu entsprechen. Anschließend wurde die Verbindung in beide Kopien von AcrA modelliert. Apo und gebundene Systeme wurden in einer ~(210-Å)3 kubischen Wasserbox solvatisiert und mit 150 mM NaCl ionisiert, was zu einer Systemgröße von ~906.000 Atomen führte.

Jedes System wurde 0,5 ns lang äquilibriert, wobei alle Protein- und Ligandenatome zurückgehalten wurden, gefolgt von 4,5 ns, wobei nur das Proteinrückgrat und die Ligandenatome zurückgehalten wurden. Anschließend wurde jedes System dreifach für 100 ns äquilibriert. Simulationen wurden je nach verwendeter Rechenressource entweder mit NAMD2.1462 oder NAMD363 und dem Kraftfeld CHARMM36m64 durchgeführt. Kraftfeldparameter für NSC-60339 wurden mit dem CGenFF-Webserver65 generiert und werden als Zusatzdaten 2 bereitgestellt. Es wurde ein Zeitschritt von 2 fs mit nicht gebundenen Wechselwirkungen im Nahbereich verwendet (Abschnitt von 12 Å mit Beginn einer Schaltfunktion). bei 10 Å) bei jedem Zeitschritt aktualisiert und die Elektrostatik mit großer Reichweite wird bei jedem zweiten Zeitschritt mit der Partikelnetz-Ewald-Methode66 aktualisiert. Mit der Langevin-Dynamik wurde eine konstante Temperatur von 310 K aufrechterhalten, während mit einem Langevin-Kolben ein konstanter Druck von 1 atm aufrechterhalten wurde. Alle präsentierten Ergebnisse wurden über drei Replikate gemittelt.

Die gesamte Systemvorbereitung und -analyse wurde mit VMD durchgeführt. RMSF und SASA wurden mit den VMD-Funktionen „Measure RMSF“ und „Measure Sasa“ gemessen. Im Fall von RMSF werden die Schwankungen anhand der durchschnittlichen Position über die abgetasteten Frames als Referenz gemessen. Die quadratische Mittelwertabweichung (RMSD) für einzelne Domänen wurde verfolgt und ist in der ergänzenden Abbildung 17 für AcrAS und in der ergänzenden Abbildung 18 für AcrASD dargestellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten HDX-MS-Daten wurden in der Quelldatendatei bereitgestellt, und die HDX-MS-Übersichtstabellen und Aufnahmediagramme wurden als Ergänzungsdaten 1 und 3 bereitgestellt. Darüber hinaus wurden die Massenspektrometrie-Proteomikdaten im hinterlegt ProteomeXchange Consortium über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD041359. Die in dieser Studie generierten MD-Simulationen wurden als Ergänzungsdaten 2 bereitgestellt. Die Proteinstrukturen aus anderen Veröffentlichungen, auf die in diesem Artikel verwiesen wird, sind unter den PDB-Zugangscodes 5O66 und 2F1M zugänglich. Die AlphaFold2-Struktur wurde aus dem UniProt-Eintrag P0AE06 generiert. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Die Arbeit am King's College London wurde durch ein UKRI Future Leaders Fellowship (MR/S015426/1) an ER und ein PhD-Stipendium des King's College London an BRL unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch das US National Institutes of Health-Stipendium R01-AI052293 an HIZ, JMP unterstützt und JCG-Rechenressourcen wurden über XSEDE (TG-MCB130173) bereitgestellt, das von der US National Science Foundation (NSF; ACI-1548562) unterstützt wird. Für diese Forschung wurden Ressourcen des Compute and Data Environment for Science (CADES) am ORNL genutzt, das von UT Battelle, LLC für DOE unter dem Vertrag DE-AC05–00OR22725 verwaltet wird. Bei dieser Arbeit wurde auch der Hive-Cluster verwendet, der von der NSF (1828187) unterstützt und von der Partnership for an Advanced Computing Environment (PACE) bei GT verwaltet wird. Das Q-Exactive Plus UHMR an der University of Leeds zur Behandlung nativer MS wurde vom Wellcome Trust finanziert (208385/Z/17/Z). AJH wurde durch einen BBSRC IPA-Zuschuss (BB/R018561/1/) in Zusammenarbeit mit GSK und UCB Pharma finanziert. Die Autoren danken Valeria Calvaresi für ihre Ratschläge bei der HDX-Analyse und -Statistik.

Fakultät für Chemie, King's College London, Britannia House, 7 Trinity Street, London, SE1 1DB, Großbritannien

Benjamin Russell Lewis, Laila MN Shah, Dietmar Hammerschmid und Eamonn Reading

Abteilung für Chemie und Biochemie, University of Oklahoma, 101 Stephenson Parkway, Norman, OK, 73019, USA

Muhammad R. Uddin, Mohammad Moniruzzaman und Helen I. Zgurskaya

Fakultät für Chemie und Biochemie, Georgia Institute of Technology, 837 State Street NW, Atlanta, GA, 30332, USA

Katie M. Kuo und James C. Gumbart

School of Molecular and Cellular Biology & Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, Leeds, Großbritannien

Anna J. Higgins und Frank Sobott

Abteilung für Biowissenschaften, Oak Ridge National Laboratory, 1 Bethel Valley Road, Oak Ridge, TN, 37831, USA

Jerry M. Parks

School of Physics, Georgia Institute of Technology, 837 State Street NW, Atlanta, GA, 30332, USA

James C. Gumbart

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BRL, JCG, HIZ und ER haben das Projekt entworfen; BRL, LMNS, DH und ER führten alle massenspektrometrischen Experimente und Analysen durch, mit Ausnahme der UHMR-Messungen, die von AH und FS durchgeführt wurden; BRL, MM, ER und HIZ klonierten, reinigten und charakterisierten alle Proteinkonstrukte. MRU und HIZ führten Bakterienausfluss- und Anfälligkeitstests und -analysen durch; KMK, JMP und JCG führten molekulare Docking- und Dynamikexperimente sowie postmolekulare Dynamikanalysen durch; FS, JMP, DH, JCG, HIZ und ER überwachten oder unterstützten das Projekt finanziell; BRL, JCG, HIZ und ER haben das Manuskript mit Beiträgen der anderen Autoren verfasst.

Korrespondenz mit James C. Gumbart, Helen I. Zgurskaya oder Eamonn Reading.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Jani Bolla, Beibei Wang und dem anderen, anonymen Gutachter für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Russell Lewis, B., Uddin, MR, Moniruzzaman, M. et al. Konformationelle Restriktion beeinflusst die Hemmung eines Multidrug-Efflux-Adapterproteins. Nat Commun 14, 3900 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39615-x

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Eingegangen: 20. Dezember 2022

Angenommen: 15. Juni 2023

Veröffentlicht: 18. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39615-x

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