Die Längsverfolgung einer akuten Nierenschädigung zeigt die Ausbreitung der Schädigung entlang des Nephrons

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4407 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Akute Nierenschädigung (AKI) ist ein wichtiger Risikofaktor für chronische Nierenerkrankung (CKD), aber die zugrunde liegenden Mechanismen der fehlgeschlagenen Tubulusreparatur und des AKI-CKD-Übergangs sind unvollständig verstanden. In dieser Studie zielten wir auf die dynamische Verfolgung von Tubulusverletzungen und -umgestaltungen ab, um zu verstehen, ob sich fokale Verletzungen bei AKI im Laufe der Zeit ausbreiten können. Hier präsentieren wir ein AKI-Modell, bei dem wir nur die Hälfte der Niere ischämisch gemacht haben. Mithilfe serieller intravitaler 2-Photonen-Mikroskopie und genetischer Identifizierung zyklischer Zellen konnten wir die dynamische Gewebeumgestaltung in post- und nicht-ischämischen Nierenregionen gleichzeitig und über einen Zeitraum von drei Wochen verfolgen. Die räumliche und zeitliche Analyse der zyklischen Zellen im Verhältnis zum anfänglichen nekrotischen Zelltod zeigte eine ausgeprägte Ausbreitung und Ausbreitung der Verletzung in nicht-nekrotische Geweberegionen, was eine Tubulusatrophie mit epithelialer VCAM1-Expression vorhersagte. Zusammenfassend liefern unsere Längsschnittanalysen der Tubulusverletzung, des Umbaus und des Schicksals wichtige Einblicke in die AKI-Pathologie.

Eine akute Nierenschädigung (AKI) ist definiert als eine plötzliche Verschlechterung der Nierenfunktion, die häufig durch eine akute Tubulusverletzung verursacht wird1. Abhängig von der Schwere der Beeinträchtigung kann sich die Nierenfunktion der Patienten erholen. Es ist jedoch mittlerweile allgemein anerkannt, dass AKI-Patienten ein hohes Risiko haben, später eine chronische Nierenerkrankung (CKD) zu entwickeln2,3. Die Mechanismen dieses AKI-CKD-Übergangs sind unvollständig geklärt3, stehen aber im Zusammenhang mit einer Funktionsstörung der Endothelzellen4,5, der Rekrutierung und Entzündung interstitieller Immunzellen6,7,8, einer interstitiellen Nierenfibrose9,10 und einer unvollständigen Reparatur des Tubulusepithels11,12. Der proximale Nierentubulus (PT) ist die Hauptverletzungsstelle bei einer Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) und erfährt eine erhebliche Umgestaltung13. Bei einer Verletzung können PT-Zellen durch De-novo-Expression von Markern wie Kim-1, Cd44 und Vimentin dedifferenzieren, sich vermehren und schließlich wieder in funktionelle PT-Zellen differenzieren14,15,16. Dennoch sind sie in ihrem dedifferenzierten Zustand auch an parakrinen Signalwegen beteiligt, die interstitielle Entzündungen, die Rekrutierung von Myofibroblasten und den anschließenden fibrotischen Umbau verstärken14,17,18,19. Aktuelle Einzelzell-Sequenzierungsstudien aus IRI-Nieren legen außerdem nahe, dass eine Untergruppe dieser dedifferenzierten PT-Zellen einen Zustand fehlgeschlagener Reparatur mit verstärkter Entzündungssignalisierung durchläuft8,11. Schließlich kann der AKI-induzierte nekrotische Zelltod direkt zu einer verstärkten Gewebeentzündung und der Förderung weiterer Verletzungen führen20,21.

Um den Übergang von AKI zu CKD zu verhindern, benötigen wir ein besseres Verständnis darüber, wie Gewebeverletzungen und Umbauprozesse mit einer erfolgreichen oder erfolglosen Genesung zusammenhängen. Es liegen jedoch nur begrenzte Längsschnittdaten vor, um dies zu untersuchen. Biopsien von AKI-Patienten werden nicht routinemäßig entnommen und weisen eine erhebliche Heterogenität im Hinblick auf den Zeitpunkt der Biopsieentnahme auf22. Darüber hinaus umfassen Tierstudien zu AKI klassischerweise die Sammlung von Organen zur weiteren Ex-vivo-Analyse. Daher werden hochdynamische AKI-induzierte Umbauprozesse aus einzelnen Schnappschüssen verschiedener Tiere und Zeitpunkte rekonstruiert. Dies schränkt den Einblick in dynamische Zell-Zell-Interaktionen und deren Einfluss auf das Schicksal von Nephronen ein. Tatsächlich sind mehrere eher grundlegende Fragen dazu, wie sich Nierengewebe nach einer Verletzung regenerieren kann, immer noch unbeantwortet oder werden kontrovers diskutiert: Welche Zellen vermehren sich als Reaktion auf eine Gewebeverletzung? Wie groß ist die Wiederherstellungsfähigkeit von verletztem Nierengewebe? Wie wird unverletztes Nierengewebe durch eine benachbarte Herdverletzung beeinflusst? Können sich Verletzungen im Laufe der Zeit ausbreiten?

In dieser Studie kombinierten wir serielle intravitale 2-Photonen-Mikroskopie (2PM) mit der genetischen Identifizierung zyklischer Zellen23 und einem Modell der partiellen Ischämie-Reperfusionsverletzung (partielle IRI), das zur Untersuchung der Auswirkungen nekrotischer Zellen auf angrenzendes unverletztes Gewebe konzipiert wurde. Die serielle Bildgebung partieller IRI-Nieren über einen Zeitraum von drei Wochen lieferte gepaarte Daten zu Tubulusverletzungen und -umgestaltungen und stellte erstmals einen Zusammenhang zwischen dem anfänglichen nekrotischen Zelltod und lokalen Stellen der Tubulusproliferation und schließlich dem Schicksal der Tubuli her. Unsere Daten identifizierten daher den frühen proximalen Tubulus als Schlüsselstelle für nekrotische Verletzungen und Quelle der Bildung von Granulatzylindern, die mit der Ausbreitung von Verletzungen und der Entwicklung einer Tubulusatrophie verbunden waren.

Um die Auswirkungen einer fokalen nekrotischen Schädigung auf unverletztes Nierengewebe bei AKI im Laufe der Zeit zu untersuchen, haben wir ein Modell einer partiellen Ischämie-Reperfusionsschädigung erstellt. Durch den Verschluss nur eines Astes der linken Nierenarterie wurde etwa die Hälfte des Organs ischämisch, während die andere Hälfte perfundiert blieb (Abb. 1a, d). Die Reperfusion erfolgte nach 21 Minuten. Am Tag 2 nach der Operation zeigten partielle IRI-Mäuse eine signifikant erhöhte Albuminausscheidung im Urin (Albumin/Kreatinin-Verhältnis (ACR), 24357,5 ± 10073,2 vs. 3333,1 ± 786,3 mg/g, Mittelwert ± SEM, p = 0,001, n = 4 und 3). partieller IRI vs. Scheinwert (Supplementary Extended Statistics.a), der sich danach wieder auf den Scheinwert erholte (Abb. 1b). Die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) wurde bei wachen Schein- und partiellen IRI-Mäusen durch Beurteilung der FITC-Sinistrin-Clearance gemessen und ergab über 7 Wochen keine Unterschiede zwischen den Gruppen (Abb. 1c).

a Schematische Darstellung des partiellen IRI-Modells. b, c Urinalbumin/Kreatinin-Verhältnis und glomeruläre Filtrationsrate (GFR) von Schein- und Teil-IRI-Mäusen (b: n = 3 und 4 Mäuse und c: n = 4 und 8 Mäuse für Schein- bzw. Teil-IRI); Mittelwert ± SEM mit Streudiagramm. Statistischer Test: Zweiwege-ANOVA mit wiederholter Messung, Faktoren: Behandlung und Tage nach der Behandlung, Post-hoc-Analyse: Mehrfachvergleiche, Bonferroni-Korrektur (Supplementary Extended Statistics.b). d Repräsentative Stereomikroskopfotos einer Mäuseniere vor und während des Verschlusses des Nierenarterienzweigs für 21 Minuten und nach der Implantation des Abdominal Imaging Window (AIW) nach Reperfusion. Bis zur Reperfusion waren ischämische und perfundierte Regionen klar erkennbar. Die AIW-Implantation wurde an der Grenzfläche zwischen ischämischen (IR), nicht-ischämischen (Nicht-IR) Regionen und dem Bereich dazwischen (Mitte) durchgeführt. Einlass: Arteriengabelung (V: Nierenvene, A: Nierenarterie, K: Niere. Pfeil zeigt Gabelung an). e In-vivo-2-Photonen-Bilder, die 2 Stunden nach der partiellen IRI aufgenommen wurden, identifizierten IR-, Mittel- und Nicht-IR-Regionen. Maßstabsbalken: 50 μm. Beachten Sie die deutliche Verringerung der blauen Autofluoreszenz in Propidiumiodid (PI)+-Tubuluszellen (Einlass, Maßstabsleiste: 30 μm). f Verteilung der nekrotischen Schädigung in Schein- und verschiedenen Schädigungsregionen von partiellen IRI-Nieren, geclustert nach dem Prozentsatz der Segmente mit dem angegebenen Schwellenwert für PI+-Kerne (% der gesamten Kerne/Segment). g Volumetrische Quantifizierung von PI+-Kernen (% der gesamten Kerne/Segment), (n = 123, 334 und 263 Segmente von 5, 7 und 6 Mäusen für Nicht-IR, Mid bzw. IR und 360 Segmente von 3 Scheinmäuse); Mittelwert ± 95 % KI mit Streudiagramm. Statistischer Test: lineares Mixed-Effect-Modell, p-Werte aus zweiseitigem Test (Supplementary Extended Statistics.c). h In-vivo-2-Photonen-Bild, das 6 Stunden nach der partiellen IRI aufgenommen wurde und die luminale Ansammlung von PI+-Zellen zeigt. Maßstabsbalken: 50 μm. *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001.

Zur Längsverfolgung von Nierenschäden und (fehlgeschlagener) Genesung wurde über der partiellen IRI-Niere ein abdominales Bildfenster (AIW) implantiert, das die wiederholte Visualisierung vollständiger ischämischer (IR), nicht-ischämischer (Nicht-IR) Bereiche usw. ermöglicht sowie die Grenzbereiche dazwischen (Mitte) (Abb. 1d). Zwei Stunden nach der Reperfusion ermöglichte in vivo 2PM von partiellen IRI-Nieren die Unterscheidung von IR-, Not-IR- und Mid-Regionen auf der Grundlage einer deutlichen räumlichen Verteilung des nekrotischen Zelltods, der durch nukleäre Propidiumiodid (PI)-Färbung nachgewiesen wurde. PI-positive Tubuluszellen zeigten außerdem eine deutlich verringerte blaue Autofluoreszenz (λEx = 750 nm, λEm = 435–485 nm), was auf eine NADH-Depletion (Nicotinamidadenindinukleotid) hinweist24 (Abb. 1e). In IR-Regionen betrug der epitheliale nekrotische Zelltod durchschnittlich 21,78 ± 1,32 % PI-positive Kerne pro Segment der Gesamtkerne (Mittelwert ± SEM, n = 263 Segmente von 6 Mäusen), wovon 76,04 % aller analysierten Tubulussegmente einen epithelialen nekrotischen Zelltod aufwiesen unterschiedlicher Schweregrad (Abb. 1f, g). In den mittleren Regionen waren deutlich weniger Verletzungen nachweisbar (6,21 ± 0,54 % nekrotische Zellen, Mittelwert ± SEM, n = 334 Tubulussegmente von 7 Mäusen, p < 0,001, Supplementary Extended Statistics.d) und 48,5 % der Segmente wiesen keine auf epithelialer nekrotischer Zelltod. In Nicht-IR-Regionen zeigten 4,88 % der untersuchten Tubuli einen vereinzelten epithelialen nekrotischen Zelltod von geringem Ausmaß, aber das Ausmaß der Nekrose unterschied sich nicht signifikant von Null (0,15 ± 0,07 % nekrotische Zellen, Mittelwert ± SEM, n = 123 Tubulussegmente). von 5 Mäusen, p = 0,28, Supplementary Extended Statistics.e), (Abb. 1f, g).

Als nächstes untersuchten wir die Verteilung des tubulären nekrotischen Zelltods nach einer ischämischen Verletzung entlang des Nephrons. Unter Verwendung von 2PM sind die proximalen Tubuli S1 (PT-S1), die proximalen Tubuli S2 (PT-S2) sowie die distalen gewundenen Tubuli, Verbindungstubuli und Tubulussegmente des Sammelkanals zugänglich25,26, von denen die letzten drei gemeinsam analysiert wurden (DCT). /CD) in dieser Studie. NADH und FADH (Flavinadenindinukleotid) spielen eine wichtige Rolle bei der PT-ATP-Produktion und sind gleichzeitig bei 750 nm mit 2PM24,27 anregbar. In Übereinstimmung mit früheren Daten25 ermöglichten unterschiedliche Muster der blauen (λEm = 435–485 nm, NADH) und grünen PT-Autofluoreszenz (λEm = 500–550 nm, FAD) (Abb. 2a, b) eine zuverlässige Unterklassifizierung zugänglicher PT-Segmente in PT- S1 und PT-S2. Somit zeigten PT-S2-Segmente im Vergleich zu PT-S1 und DCT/CD eine deutlich stärkere grüne und blaue Fluoreszenz, und das Verhältnis von grünem/blauem Emissionslicht ermöglichte eine signifikante Unterscheidung von PT-S1, PT-S2 und DCT/CD. bzw. (Abb. 2b). Darüber hinaus zeigte die Bolusverfolgung während der iv-Injektion von frei gefiltertem FITC-konjugiertem 4 kDa-Dextran bei 4 Mäusen deutlich verzögerte Bolusankunftszeiten in als PT-S2 klassifizierten Tubulussegmenten im Vergleich zu denen, die als PT-S1 klassifiziert waren (Abb. 2c). Von den 875 analysierten Tubulussegmenten von Mäusen mit partiellem IRI waren 8,7 % aufgrund schwerer Nekrose nicht klassifizierbar und von der Klassifizierung ausgeschlossen.

Ein In-vivo-2-Photonen-Bild eines gesunden Mausglomerulus (g) und der umgebenden Tubuli ermöglicht eine klare Unterscheidung zwischen proximalen S1- (PT-S1), proximalen S2- (PT-S2) und distalen gewundenen/Sammelkanaltubuli (DCT/CD). ) basierend auf unterschiedlichen morphologischen und Autofluoreszenzmustern. Maßstabsbalken: 50 μm. b Die Identität der Tubulussegmente kann auf der Grundlage einer quantitativen Bewertung der grünen (λEm = 500–550 nm) und blauen (λEm = 435–485 nm) Autofluoreszenz des tubulären Epithels zugeordnet werden, die bei λEx = 750 nm (n = 152, 190 und 38 Segmente) aufgezeichnet wurde für PT-S1, PT-S2 und DCT/CD von 4 Mäusen jeweils 24 Stunden nach partieller IRI); Boxplot, Linie am Median, Kanten am 25. und 75. Perzentil, Whiskers von Minimum bis Maximum, einzelne Punkte gelten als Ausreißer. Statistischer Test: lineares Mixed-Effect-Modell, p-Werte aus zweiseitigen Tests (Supplementary Extended Statistics.f). c Oberes Feld: Repräsentative In-vivo-2-Photonen-Bilder, die während der Bolusinjektion von FITC-4kDa-Dextran aufgenommen wurden, zeigen die Ankunft von gefiltertem FITC-4kDa-Dextran zunächst in als PT-S1 und später in als PT-S2 klassifizierten Tubuli. Maßstabsbalken: 50 μm. Unteres Feld: Luminale FITC-4kDa-Dextran-Fluoreszenz, gemessen in PT-S1- und PT-S2-Segmenten über die Zeit (n = 15 bzw. 14 Segmente von 4 Mäusen); Mittelwert ± SEM. d In-vivo-2-Photonen-Bild einer partiellen IRI-Niere (ischämische Region) 2 Stunden nach der Reperfusion zeigt die Verteilung von Propidiumiodid (PI)+-Kernen über verschiedene Tubulussegmente. Maßstabsbalken: 50 μm. e Verteilung der nekrotischen Schädigung in IR-Regionen von partiellen IRI-Nieren über verschiedene Nephronsegmente hinweg, geclustert nach dem Prozentsatz der Segmente mit dem angegebenen Schwellenwert für PI+-Kerne (% der gesamten Kerne/Segment). f, g Volumetrische Quantifizierung von PI+-Kernen (% der gesamten Kerne/Segment) entlang verschiedener Tubulussegmente in IR-Regionen (n = 195, 90, 105 Segmente für PTs, PT-S1, PT-S2 von 6 Mäusen und 14 DCT/ CD von jeweils 4 Mäusen); Mittelwert ± 95 % KI mit Streudiagramm. Statistischer Test: lineares Mixed-Effect-Modell, p-Werte aus zweiseitigen Tests (Supplementary Extended Statistics.g). *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001.

Wie erwartet waren PT-Segmente stärker verletzt als DCT/CD-Segmente. In IR-Regionen betrug der nekrotische Zelltod in PT-Segmenten durchschnittlich 20,41 ± 1,49 % PI-positive Kerne (n = 195 Segmente von 6 Mäusen), wovon 72,82 % aller proximalen Tubulussegmente einen nekrotischen Zelltod unterschiedlicher Schwere aufwiesen. Im Gegensatz dazu war der nekrotische Zelltod in DCT/CDs von IR-Regionen im Vergleich zu PT-Segmenten insgesamt von geringem Ausmaß (2,89 ± 0,75 % PI-positive Kerne, n = 14 Segmente von 4 Mäusen, p < 0,001 vs. PTs, Supplementary Extended Statistics). .h) wobei 57,14 % aller DCT/CD-Segmente den Tod vereinzelter nekrotischer Zellen zeigten (<10 % PI+-Kerne gegenüber der Gesamtzahl der Kerne). Bei der Unterscheidung zwischen PT-S1- und PT-S2-Segmenten beobachteten wir einen signifikant höheren Grad an nekrotischem Zelltod in PT-S1-Segmenten (26,19 ± 2,45 % PI-positive Kerne, n = 90 Tubulussegmente von 6 Mäusen) als in PT-S1-Segmenten. S2 (15,45 ± 1,68 % der PI-positiven Kerne, n = 105 Segmente von 6 Mäusen, p < 0,001, Supplementary Extended Statistics.i) (Abb. 2e, f). Ähnliche Ergebnisse wurden bei der gemeinsamen Analyse der IR- und Mid-Regionen und bei der Normalisierung der Anzahl PI-positiver Zellen über die gesamte Tubulusquerschnittsfläche und nicht über die gesamte Kernzahl erzielt (ergänzende Abbildung 1).

Der durch PI-Färbung nachgewiesene nekrotische Zelltod trat nur innerhalb der ersten Stunden nach der Reperfusion auf. Zwei Stunden nach der Reperfusion schienen die meisten PI-positiven Zellen immer noch an der Basalmembran zu haften. Allerdings beobachteten wir 6 Stunden nach der Reperfusion ein massives Austreten nekrotischer Zellen in das tubuläre Lumen (Abb. 1h).

Bei der zeitlichen Verfolgung postischämischer Tubuli mittels intravitaler 14-Uhr-Bildgebung konnten wir neben erkennbaren Autofluoreszenzmustern und Materialien deutliche morphologische Veränderungen des remodellierenden Epithels feststellen. Für eine gründliche pathologische Klassifizierung der beobachtbaren Ereignisse führten wir serielle Kryoschnitte fixierter postischämischer Nieren (n = 3) durch, von denen zwei auf Hämatoxylin-Eosin (HE) bzw. Periodic Acid-Schiff (PAS)-Färbung gefärbt wurden. Ein dritter Serienschnitt wurde um 14:00 Uhr mit den gleichen Einstellungen wie in vivo aufgenommen. Mithilfe von Kryoschnitten um 14:00 Uhr identifizierten wir typische Remodellierungsereignisse, wie sie in vivo häufig beobachtet werden, und identifizierten diese interessierenden Regionen dann in aufeinanderfolgenden HE- und PAS-gefärbten Schnitten mithilfe korrelativer Mikroskopie erneut (ergänzende Abbildung 2). Korrelierte Mikroskopiebilder von Gefrierschnitten sowie In-vivo-2-Photonen-Bilder aus dieser Studie wurden von einem erfahrenen Pathologen gescreent und klassifiziert. Die folgenden Phänomene wurden klassifiziert und weiter untersucht: (1) Die luminale Ansammlung von stark autofluoreszierenden Zelltrümmern in den Tubuli wurde als körnige Zylinder und akute Tubulusnekrose (ATN) identifiziert. (2) Erweiterte Tubuli mit abgeflachtem und vereinfachtem Epithel wurden als akute Tubulusverletzung (ATI) identifiziert. (3) Kollabierte und helle autofluoreszierende Tubuli mit fragmentiertem Aussehen wurden als atrophisch identifiziert (ergänzende Abbildung 2).

Um den epithelialen Zellzyklus nach AKI in vivo und im Zeitverlauf zu untersuchen, führten wir serielle In-vivo-Bildgebung von transgenen CycB1-GFP-Reportermäusen durch, die darauf hinweisen, dass Zellen durch vorübergehende GFP-Expression in die Phasen S, G2 und M des Zellzyklus eintreten23 (Abb. 3a). und ergänzende Abbildung 5). Um zu bestätigen, dass CycB1-GFP-Mäuse tatsächlich proliferierende Zellen anhand der GFP-Expression identifizierten, injizierten wir 4 Tage lang täglich EdU und führten gleichzeitig eine In-vivo-Bildgebung der GFP-Expression in den Nieren durch. Nach Perfusionsfixierung und Ex-vivo-EdU-Markierung führten wir dann eine korrelative Bildgebung durch und bestätigten, dass GFP-exprimierende Zellen auch als EdU-inkorporierende Zellen identifiziert wurden (ergänzende Abbildung 4). Anschließend quantifizierten wir die tubuläre GFP-Expression in seriell abgebildeten Schein- und partiellen IRI-CycB1-GFP-Nieren. Die GFP-Expression in Scheinnieren war über einen Zeitraum von 3 Wochen im Allgemeinen niedrig (Ergänzungstabelle 1, Abb. 3b und Ergänzende Abb. 5a). In partiellen IRI-Nieren stieg die Anzahl der GFP-exprimierenden Epithelzellen innerhalb der ersten Woche nach der Reperfusion an, erreichte am Tag 3 ihren Höhepunkt und war mit einer deutlichen Abflachung des Epithels und einem Verlust des Tubulusbürstenrandes verbunden, was auf ATI hinweist (Abb. 3a). In Woche 2 und 3 nach der Reperfusion sank die epitheliale GFP-Expression in partiellen IRI-Nieren auf Scheinwerte (Ergänzungstabelle 1, Abb. 3b und Ergänzende Abb. 5a). Als nächstes analysierten wir die GFP-Expression in IR-, Mid- und Not-IR-Regionen von partiellen IRI-Nieren sowie im Zeitverlauf. Zwei Stunden nach der Reperfusion gab es keinen Unterschied zwischen den Gruppen. Die GFP-Expression in IR-Bereichen begann ab Tag 1 zuzunehmen und war zwischen Tag 1 und 4 nach der Reperfusion signifikant höher als in Regionen mit mittlerem und nicht IR-Bereich (Ergänzungstabelle 1, Abb. 3c und Ergänzende Abb. 5b). Im Gegensatz dazu stieg die GFP-Expression in den mittleren Regionen im Vergleich zu den Nicht-IR-Regionen erst ab Tag 2 an und blieb bis zum siebten Tag nach der Reperfusion erhöht. Sieben Tage nach der Reperfusion war die GFP-Expression in den IR- und Mid-Regionen vergleichbar, aber im Vergleich zu den Nicht-IR-Regionen erhöht. An den Tagen 14 und 21 nach der Reperfusion gab es keinen Unterschied zwischen den Gruppen (Ergänzungstabelle 1, Abb. 3c und Ergänzungstabelle 5b). In Nicht-IR-Regionen war die proliferative Aktivität im Allgemeinen gering. An den Tagen 2 und 3 nach der Reperfusion stieg die GFP-Expression jedoch leicht an und erreichte im Vergleich zur Scheinuntersuchung signifikant höhere Werte (Ergänzungstabelle 1, Ergänzungseinlass zu Abb. 5a).

Eine serielle In-vivo-2-Photonen-Mikroskopie einer ischämischen Region in einer partiellen IRI-CycB1-GFP-Reporter-Mausniere an den Tagen 0, 1, 2 und 3 nach der Reperfusion zeigt eine zunehmende GFP-Expression (Pfeilspitzen) im Laufe der Zeit. Maßstabsbalken: 100 μm. b–d Volumetrische Quantifizierung der GFP-Expression (% der gesamten Kerne/Segment) über verschiedene Versuchsgruppen (b: Schein- und Teil-IRI), verschiedene Bereiche mit teilweiser IRI-Verletzung (c: Nicht-IR, IR und Mittel) und verschiedene Nephrone Segmente in den IR- und Mittelregionen der partiellen IRI-Nieren (d: PT-S1, PT-S2 und DCT/CD). Daten von n = 3 Schein- und 9 Teil-IRI-Mäusen. Detaillierte Informationen zur Anzahl der Tubulussegmente pro Gruppe finden Sie in der Ergänzungstabelle 1 (b, c) und der Ergänzungstabelle 2 (d). Boxplot, Linie am Median, Kanten am 25. und 75. Perzentil, Whiskers von Minimum bis Maximum, einzelne Punkte gelten als Ausreißer. Eine Übersicht über denselben Datensatz, einschließlich eines erweiterten statistischen Vergleichs, ist in der ergänzenden Abbildung 5 dargestellt. Statistischer Test: lineares Mixed-Effect-Modell, p-Werte aus zweiseitigen Tests (Supplementary Extended Statistics.j). #: signifikanter Unterschied innerhalb der Gruppe im Vergleich zum jeweiligen Tag 0; #: p < 0,05; ##: p < 0,01; ###: p < 0,001. e Repräsentatives In-vivo-2-Photonen-Bild der epithelialen GFP-Expression in einer IR-Region einer CycB1-GFP-Niere 2 Tage nach partieller IRI. Maßstabsbalken: 75 μm.

Abschließend beurteilten wir die gesamte tubuläre segmentspezifische Proliferationskapazität nach partieller IRI. Einen Tag nach der Reperfusion stellten wir fest, dass PT-S1-Segmente stärker proliferierten als PT-S2- bzw. DCT/CD-Segmente. An den Tagen 2 und 3 stieg die epitheliale GFP-Expression in den PT-S2-Segmenten jedoch drastisch an und übertraf die von PT-S1 bzw. DCT/CD. An den Tagen 7, 14 und 21 nach der Reperfusion gab es keinen Unterschied zwischen den Gruppen (Ergänzungstabelle 2, Abb. 3d und Ergänzungstabelle 5c).

Um zu verstehen, ob die beobachtete epitheliale proliferative Aktivität von zufälligen Nachbarzellen nekrotischer Zellen oder vielmehr von verstreuten vorläuferähnlichen Zellen herrührt, haben wir die räumliche Verteilung der proliferierenden Zellen im Verhältnis zu den am Tag 0 entdeckten nekrotischen Zellen analysiert. Dazu haben wir die Anzahl der Zellen aufgetragen GFP-exprimierende Tubuluszellen, die in unmittelbarer Nähe einer nekrotischen Zelle entstehen (Radius < 25 µm), sowie die Anzahl der GFP-exprimierenden Zellen, die außerhalb eines Radius von 25 µm einer bestimmten nekrotischen Zelle innerhalb eines Tubulussegments entstehen. Im Durchschnitt beobachteten wir eine signifikant höhere Anzahl epithelialer GFP-Zellen, die sich in unmittelbarer Nähe von PI-positiven Kernen befanden (2,27 ± 0,15 %), im Vergleich zu denen, die in entfernter Lokalisierung nachgewiesen wurden (1,62 ± 0,14 %, Mittelwert ± SEM, n = 336 Segmente). von 4 Mäusen für beide Gruppen, p < 0,001, Supplementary Extended Statistics.l). Bemerkenswert ist, dass eine genauere Untersuchung deutliche Unterschiede zwischen den Segmenttypen zeigte: In PT-S1-Segmenten erschienen zyklische Zellen fast ausschließlich neben nekrotischen Stellen. In PT-S2-Segmenten begann der Zellzyklus in der unmittelbaren Nähe nekrotischer Stellen. Allerdings entdeckten wir innerhalb der ersten drei Tage eine allmählich wachsende Population GFP-exprimierender Zellen, die in der entfernten Lokalisierung aller am Tag 0 entdeckten nekrotischen Zellen entstand. Ähnliche Dynamiken wurden für DCT/CD-Segmente im Zeitverlauf erhalten. Der Großteil der in dieser Gruppe beobachteten Proliferation war jedoch auf GFP-Zellen zurückzuführen, die in großer Entfernung von nekrotischen Stellen auftraten (Ergänzungstabelle 3, Abb. 4a – d). Diese Daten zeigten, dass überlebende benachbarte Zellen zwar einen wesentlichen Teil der proliferierenden Zellen ausmachten, zusätzliche induktive Mechanismen jedoch in PT-S2- bzw. DCT/CD-Segmenten offensichtlich zu sein schienen.

a, b Serielle In-vivo-2-Photonen-Mikroskopiebilder repräsentativer Mid-Regionen in CycB1-GFP-Reporter-Nieren an den angegebenen Tagen nach partieller IRI. Beachten Sie die lokalisierte GFP-Expression (Pfeilspitzen) um nekrotische Stellen (⊥) in PT-S1-Segmenten, während die GFP-Expression auch in entfernter Entfernung nekrotischer Stellen (⊥) in PT-S2 auftritt. Maßstabsbalken: 50 μm. c Kumulative volumetrische Quantifizierung von GFP-exprimierenden Kernen (% der gesamten Kerne/Segment), bestimmt an den Tagen 1–3 nach partieller IRI für PT-S1, PT-S2 und DCT/CD, die entweder in der Nähe (<25 μm) entstanden sind oder entfernte Lokalisierung (>25 μm) von jeder am Tag 0 nachgewiesenen Propidiumiodid (PI)+-Zelle (n = 145, 184 und 37 Segmente von 4 Mäusen für PT-S1, PT-S2 bzw. DCT/CD); Mittelwert ± 95 % KI mit Streudiagramm. Statistischer Test: zweiseitiger gepaarter t-Test mit p < 0,05 als signifikant (Supplementary Extended Statistics.k). d Der gleiche Datensatz wie in (c) wird angezeigt, um unterschiedliche Positionen proliferierender Tubuluszellen in verschiedenen Tubulussegmenten über Tage nach partieller IRI aufzudecken (n = 4 partielle IRI-Mäuse; detaillierte Informationen zu Segmentnummer/-gruppe finden Sie in der Ergänzungstabelle 3); Mittelwert ± 95 % KI mit Streudiagramm. Statistischer Test: lineares Mixed-Effect-Modell, p-Werte aus zweiseitigem Test (Supplementary Extended Statistics.m). e Volumetrische Quantifizierung der tubulären GFP-Expression (% der gesamten Kerne/Segment), gruppiert nach nekrotischen Schwellenwerten (n = 223, 140, 157 PT-S1-Segmente und 250, 237, 103 PT-S2-Segmente für nicht nekrotisch, mittelschwer und schwer). , bzw. von 6 Mäusen); Mittelwert ± 95 % KI mit Streudiagrammen. Statistischer Test: lineares Mixed-Effect-Modell, p-Werte aus zweiseitigem Test (Supplementary Extended Statistics.n). f Lineare Regression der PI+-Kerne (% der Gesamtkerne/Segment) am Tag 0 und der kumulativen GFP+-Kerne (% der Gesamtkerne/Segment) ab den Tagen 1, 2 und 3 für PT-S1- und PT-S2-Segmente (n = 144). und 180 von 4 Mäusen). Fit (Steigung*x + Achsenabschnitt, aufgetragen mit 95 %-KI), R2 und Pearson-Koeffizient (r) werden für beide angegeben. #: signifikanter Unterschied zwischen Steigung und Achsenabschnitt von Null. *: Signifikanztest über Gruppen hinweg, p-Werte aus zweiseitigem Test. */#: p < 0,05; **/##: p < 0,01; ***/###: p < 0,001.

Um den verletzungsabhängigen Zellzyklus in PT-S1- und PT-S2-Segmenten besser zu verstehen, analysierten wir die dynamische GFP-Expression von nicht nekrotischen (0 % nekrotischer Zelltod am Tag 0) und mäßig nekrotischen (0–20 % nekrotischer Zellen am Tag 0). ) und stark nekrotische Tubulussegmente (>20 % nekrotische Zellen am Tag 0). In Übereinstimmung mit den obigen Ergebnissen beobachteten wir an den Tagen 2 und 3 eine signifikant höhere GFP-Expression in nicht-nekrotischen und mäßig nekrotischen PT-S2-Segmenten im Vergleich zu den jeweiligen PT-S1-Segmenten (Abb. 4e). Unter den stark nekrotischen Segmenten proliferierten die PT-S1-Segmente am ersten Tag stärker als die PT-S2-Segmente. Allerdings stieg die GFP-Expression in den stark nekrotischen PT-S2-Segmenten ab Tag 2 schnell an und übertraf die in den PT-S1-Segmenten an den Tagen 3 und 7 beobachtete (Abb. 4e). Schließlich wollten wir untersuchen, ob PT-S1 und PT-S2 unterschiedliche Fähigkeiten zur Proliferation bei einem nekrotischen Zelltod eines bestimmten Ausmaßes aufweisen. Daher führten wir eine lineare Regression der am Tag 0 beobachteten PI-positiven Kerne (% der Gesamtkerne) und der kumulativen Anzahl der GFP-positiven Kerne (% der Gesamtkerne) durch, die an den Tagen 1 bis 3 nach der partiellen IRI beobachtet wurden. Sowohl für PT-S1- als auch für PT-S2-Segmente wurde eine signifikante Korrelation zwischen der anfänglichen Anzahl nekrotischer Zellen und der nachfolgenden proliferativen Reaktion festgestellt (Abb. 4f). Bemerkenswert ist, dass es keinen signifikanten Unterschied in den Steigungen der linearen Regressionen gab, was auf eine vergleichbare Nekrose-induzierte proliferative Reaktion in den Segmenten PT-S1 und PT-S2 hinweist (Abb. 4f). Wir stellten jedoch einen signifikant höheren Schnittpunkt in der linearen Regression von PT-S2-Segmenten fest (Abb. 4f), was eine Population von PT-S2-Segmenten zeigte, die sich ohne vorherige nekrotische Verletzung vermehrten. Im Gegensatz dazu unterschied sich der Achsenabschnitt der linearen PT-S1-Regressionsgleichung statistisch nicht von Null, was bestätigt, dass die Proliferation in diesen Segmenten streng vom Vorliegen einer anfänglichen nekrotischen Verletzung abhängt.

Um zu verstehen, warum sich PT-S2-Segmente ohne nekrotischen Zelltod vermehrten, haben wir die beobachtbaren Umbauprozesse in partiellen IRI-Nieren im Laufe der Zeit genau registriert. Eine nekrotische Verletzung bei PT war mit dem Abwurf toter Tubuluszellen und apikalem Membranmaterial in das Tubuluslumen verbunden (Abb. 1h, 4a, b). Ab Tag 1 nach der Reperfusion beobachteten wir eine ausgeprägte luminale Granulatbildung (Abb. 5c), die im Laufe der Zeit stromabwärts entlang des Nephrons floss (Abb. 4b, Zusatzfilm 1) und schließlich auch im Lumen zuvor nicht nekrotischer Nephronsegmente auftrat (Abb. 4b, 5a). Anschließend haben wir die Lumenfläche der körnigen Abgüsse in der Z-Stapelebene mit dem größten Tubulusdurchmesser quantifiziert und auf die Querschnittsfläche des jeweiligen Tubulussegments in derselben Tiefe normiert. Die Ansammlung von Granulatzylindern war in nekrotischen (3,81 ± 0,51 %, n = 274 Segmenten von 3 Mäusen) und nicht nekrotischen PT-S2-Segmenten (4,04 ± 0,43 %, n = 269 Segmente von 4 Mäusen) nachweisbar, war jedoch in den jeweiligen PT-S2-Segmenten vernachlässigbar. S1-Segmente (nekrotisch: 0,14 ± 0,13 %, n = 221 Segmente von 4 Mäusen; nicht nekrotisch: 0 %, n = 213 Segmente von 4 Mäusen) (Abb. 5d).

a Repräsentative serielle In-vivo-2-Photonen-Mikroskopiebilder einer mittleren Region in CycB1-GFP-Nieren am Tag 0, 1 und 2 nach partieller IRI. Beachten Sie, wie GFP+-Zellen (Pfeilspitzen) einen Tag nach der Ansammlung von Granulatzylindern (Pfeile) in anfänglich nicht nekrotischen Segmenten (PI-negativ am Tag 0) erscheinen. Maßstabsbalken: 100 μm. b Repräsentatives Stereomikroskopfoto einer Mäuseniere während des Verschlusses des Nierenarterienzweigs, das einen typischen Grenzbereich zwischen den perfundierten und ischämischen Nierenbereichen zeigt. c, d Luminaler Granulatgussbereich, gemessen an der größten Querschnittsebene jedes röhrenförmigen Segments und normalisiert durch die Querschnittsfläche des jeweiligen Segments bei derselben Bildgebungstiefe, gruppiert nach Tagen nach partieller IRI (c) (n = 468). , 328, 329 und 320 Segmente für die jeweiligen Tage von 6 (Tag 00) und 4 (Tag 01–03) Mäusen) und Segmenttyp in Abwesenheit oder Anwesenheit von Nekrose (d) (n = 213 und 221 für). nicht-nekrotisches und nekrotisches PT-S1 von 4 Mäusen; 269 und 274 Segmente für nicht-nekrotisches und nekrotisches PT-S2 von 4 bzw. 3 Mäusen). Jeder Tubulus mit >1 % PI+ nekrotischen Zellen am Tag 0 wurde als nekrotisch eingestuft; Mittelwert ± 95 % KI mit Streudiagrammen. Statistischer Test: lineares Mixed-Effect-Modell, p-Werte aus zweiseitigem Test, keine Anpassung für Mehrfachvergleiche (Supplementary Extended Statistics.o). e Lineare Regression der luminalen Granulatgussfläche (% der gesamten Querschnittsfläche des Segments) und der GFP+-Kerne (% der gesamten Kerne/Segment, bewertet in 3D), gemessen 24 Stunden später im selben Segment und proliferierend außerhalb eines 25-µm-Radius von jedem PI+-Kern (n = 179 und 184 für nicht-nekrotische und nekrotische Segmente von 4 bzw. 3 Mäusen). Anpassung (Steigung*x + Achsenabschnitt, dargestellt mit 95 %-KI); Für beide werden R2 und der Pearson-Korrelationskoeffizient (r) angegeben. #: signifikanter Unterschied zwischen Steigung und Achsenabschnitt von Null. *: signifikanter Unterschied zwischen den Segmenttypen, p-Werte aus zweiseitigem Test, */#: p < 0,05; **/##: p < 0,01; ***/###: p < 0,001.

Bemerkenswert ist, dass die Ansammlung körniger Zylinder in PT-S2-Segmenten räumlich mit der GFP-Expression einen Tag später zusammenfiel und scheinbar unabhängig von der anfänglichen nekrotischen Verletzung in den jeweiligen Segmenten war (Abb. 5a). Um einen Zusammenhang zwischen der Ansammlung von Granulatzylindern und dem Zellzyklus in PT-S2-Segmenten weiter zu untersuchen, haben wir die Ausdehnung der luminalen Granulatzylinder über den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen aufgetragen, die außerhalb eines Radius von 25 µm eines bestimmten nekrotischen Kerns im selben Tubulus austreten Segmente 24 Stunden später. Die lineare Regressionsanalyse für nicht nekrotische PT-S2-Segmente zeigte eine signifikante Korrelation zwischen dem Ausmaß der Ansammlung von Granulatzylindern und der einen Tag später beobachteten GFP-Expression (Abb. 5e). Im Gegensatz dazu ergab die gleiche Analyse, die ausschließlich an nekrotischen PT-S2-Segmenten durchgeführt wurde, eine deutlich geringere Steigung und R2, aber einen höheren Schnittpunkt (Abb. 5e). Zusammengenommen deuteten diese Längsschnittanalysen von Remodellierungsereignissen in partiellen IRI-Nieren auf eine Verletzungsausbreitung entlang des proximalen Tubulus hin, was durch die Ansammlung von körnigem Zylinder in zuvor nicht nekrotischen stromabwärts gelegenen Tubulussegmenten bestimmt wurde, was mit ihrem späteren Engagement für die Proliferation korrelierte.

Als nächstes testeten wir die Hypothese, dass eine verzögerte Proliferation in körnigen Gips-ansammelnden, nicht nekrotischen Tubulussegmenten unabhängig von einer potenziell subletalen IRI-induzierten Verletzung auftrat. Um dies zu erreichen, fügten wir einzelnen PT-S1-Segmenten eine selektive nekrotische Verletzung zu, um zu untersuchen, ob dies zu einer Ansammlung und Proliferation von körnigem Zylinder in nachgeschalteten PT-S2-Segmenten führen würde. Daher verwendeten wir den 2-Photonen-Laser als Mikromanipulator14,28,29,30,31, um durch fokussierte Laserbelichtung selektive und fokale Verletzungen in PT-S1-Segmenten gesunder CycB1-GFP-Nieren hervorzurufen. Dies führte zu einer selektiven PI-Aufnahme im lasergesteuerten PT-S1-Epithel ohne erkennbare nekrotische Schädigung im umgebenden Niereninterstitium oder Tubulusepithel (Abb. 6b, c). Anschließend haben wir potenzielle Umbauprozesse im Laufe der Zeit mithilfe serieller 14:00 Uhr weiterverfolgt. Wie erwartet löste die Laserverletzung eine ausgeprägte Epithelproliferation in den gezielten PT-S1-Segmenten aus (Abb. 6b, c). Bemerkenswert ist, dass die fokale laserinduzierte PT-S1-Verletzung auch eine Ansammlung von körnigem Gips in einigen der umgebenden PT-S2-Tubulussegmente verursachte. In Übereinstimmung mit unseren vorherigen Erkenntnissen beobachteten wir deutlich mehr GFP+-Kerne in PT-S2-Segmenten, die luminale Granulatzylinder ansammelten, als in denen, die dies nicht taten (8,35 ± 1,47 %, n = 39 vs. 0,46 ± 0,07 %, n = 461, p < 0,001, Abb. 6d, Supplementary Extended Statistics.u) und die lineare Regressionsanalyse zeigten eine signifikante Korrelation zwischen der Häufigkeit von luminalen Granulatzylindern in unverletzten PT-S2-Segmenten und der offensichtlichen GFP-Expression 24 Stunden später (Abb. 6e). Darüber hinaus bestätigten tägliche EdU-Injektionen während Laserverletzungsexperimenten und anschließende korrelative Bildgebung die tatsächliche Proliferation von GFP-exprimierenden Kernen, wie sie in vivo beobachtet wurden, durch deutliche Überlappung mit EdU-inkorporierenden Kernen, wie sie ex vivo sichtbar gemacht wurden (ergänzende Abbildung 4b). Um auf unspezifische, laserinduzierte subletale Verletzungen und Proliferation in umgebenden Tubulussegmenten zu testen, analysierten wir die Gesamtzahl der epithelialen GFP+-Kerne in verschiedenen Bereichszonen, die durch zunehmenden Abstand zur basolateralen Membran der jeweiligen laserzielgerichteten PT-S1-Segmente definiert wurden (Abb. 6f). Falls die Ansammlung von Granulatzylindern und die anschließende GFP-Expression in nicht anvisierten PT-S2-Segmenten auf eine unspezifische und subletale Laserverletzung zurückzuführen sind, sollte die Anzahl der GFP+-Kerne in unmittelbarer Nähe der Verletzungsstelle am höchsten sein. Allerdings zeigten direkt an die lasergeschädigten PT-S1-Segmente angrenzende Tubuli (0–35 µm) im Vergleich zu Tubuli, die zwischen 35–85 und 85–135 µm vom verletzten PT-S1-Segment entfernt waren, keine stärkere epitheliale GFP-Expression ( Abb. 6f). Diese Daten deuten darauf hin, dass körnige, sich im Gips ansammelnde PT-S2-Röhrchensegmente stromabwärts gelegene Teile desselben Nephrons wie das lasergesteuerte PT-S1-Segment darstellten und sich unabhängig von unspezifischen Laserverletzungen vermehrten. In Übereinstimmung mit dieser Annahme befanden sich körnige, sich im Gips ansammelnde und proliferierende PT-S2-Segmente häufig in einem angemessenen Abstand vom lasergesteuerten PT-S1-Segment (Abb. 6c), während die meisten verletzungsumgebenden Tubulussegmente keine Anzeichen dafür aufwiesen Verletzung und/oder Zellumbau (Abb. 6b, c). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass eine selektive laserinduzierte PT-S1-Verletzung eine Ansammlung von Granularzylindern in gesunden stromabwärts gelegenen Tubulusepithelien hervorruft, die sich anschließend zur Proliferation begeben.

Serielle In-vivo-2-Photonen-Mikroskopiebilder repräsentativer CycB1-GFP-Nierenregionen ohne (a) und mit selektiver fokaler PT-S1-Verletzung (b, c) durch gezielte 2-Photonen-Laserbelichtung (orange Linie). b Repräsentative Bildserie vor und nach einer laserinduzierten fokalen PT-S1-Verletzung, bei der keine körnige Zylinderansammlung in den umgebenden PT-S2-Segmenten erkennbar war. Beachten Sie die lokale Proliferation (Pfeilspitzen) im gezielten PT-S1-Segment ohne unspezifische Epithelschädigung oder Proliferation in den umgebenden Tubulussegmenten. c Repräsentative Bildserie vor und nach einer laserinduzierten fokalen PT-S1-Verletzung, in der eine luminale Ansammlung körniger Zylinder (Pfeile) und eine anschließende GFP-Expression (Pfeilspitzen) in umgebenden, zunächst unverletzten PT-S2-Segmenten in weiter Entfernung zur Verletzungsstelle erkennbar waren. Maßstabsbalken: 50 μm. d Volumetrische Quantifizierung von GFP+-Kernen (% der gesamten Kerne/Segment) in nicht-granulären, zylinderakkumulierenden (ungegossenen) und granulären, zylinderakkumulierenden (gegossenen) PT-S2-Segmenten am Tag 02 nach der fokalen PT-S1-Verletzung (n = 461 und 39 für ungegossene und gegossene Segmente, von 7 Mäusen); Boxplot, Linie am Median, Kanten am 25. und 75. Perzentil, Whiskers von Minimum bis Maximum, Punkte gelten als Ausreißer. Statistischer Test: lineares Mixed-Effect-Modell, p-Werte aus zweiseitigem Test (Supplementary Extended Statistics.u). e Lineare Regression der luminalen Granulatgussfläche (% der gesamten Querschnittsfläche des Segments) am Tag 01 und GFP+-Kerne (% der gesamten Kerne/Segment), gemessen 24 Stunden später in unverletzten PT-S2-Segmenten (n = 498 von 7 Mäusen) . Anpassung (Steigung*x + Achsenabschnitt, dargestellt mit 95 %-KI); R2 und der Pearson-Koeffizient (r) werden angegeben. #: signifikanter Unterschied zwischen Steigung und Achsenabschnitt von Null. f Die normalisierte Anzahl von GFP+-Kernen, die in verschiedenen Bereichszonen nachgewiesen wurden, die durch zunehmenden Abstand von der basolateralen Membran des lasergeschädigten PT-S1-Segments definiert werden, weist auf keine unspezifische laserinduzierte Proliferation in an die Verletzung angrenzenden Tubuli (0–35 µm) hin. (n = 20 für jede Flächenzone von 7 Mäusen); Boxplot, Linie am Median, Kanten am 25. und 75. Perzentil, Whiskers vom Minimum zum Maximum, einzelne Punkte gelten als Ausreißer. Statistischer Test: lineares Mixed-Effect-Modell, p-Werte aus zweiseitigem Test (Supplementary Extended Statistics.u). */#: p < 0,05; **/##: p < 0,01; ***/###: p < 0,001.

Längsschnitt-intravitale 2PM-Bildgebung von partiellen IRI-Nieren über 21 Tage dokumentierte eine postischämische Epithelschädigung und nachfolgende Umbauereignisse, die entweder zu einer Tubuliatrophie oder einer Erholung führten (Abb. 7 und ergänzende Abb. 6). Bei der Analyse der zeitlichen Verteilung der Schicksalsbestimmung stellten wir fest, dass das Schicksal von 77 % aller sich erholenden und 55 % aller atrophischen Tubuli bereits am Tag 7 nach der Reperfusion bestimmt war. Bis zum 14. Tag wurde das Schicksal weiterer 21 % und 34 % der sich erholenden und verkümmernden Tubuli bestimmt (Abb. 7g), was darauf hindeutet, dass die meisten schicksalentscheidenden Umbauprozesse innerhalb der ersten 1–2 Wochen nach der Reperfusion stattfanden. Um zu testen, ob sich wiederhergestellte Tubuli auch funktionell regenerierten, haben wir die dynamische Albumin-Wiederaufnahmekapazität als Verhältnis von fluoreszenzmarkiertem Albumin im apikalen Tubulusbürstenrand und im Lumen peritubulärer Kapillaren gemessen14. Am Tag 0 war die Albumin-Wiederaufnahmekapazität der sich erholenden Tubuli im Vergleich zu unverletzten partiellen IRI- und Schein-PTs deutlich reduziert, erholte sich jedoch am Tag 7 auf die Scheinwerte. Im Gegensatz dazu blieb die Albumin-Wiederaufnahmekapazität in Tubuli, die atrophisch wurden, über den gesamten Beobachtungszeitraum niedrig ( Abb. 7a, b, Zusatzfilme 2 und 3).

a Serielle In-vivo-2-Photonen-Mikroskopiebilder repräsentativer mittlerer und IR-Regionen in CycB1-GFP-Nieren an den angegebenen Tagen nach teilweiser IRI zeigen die GFP-Expression (Pfeilspitzen) im abgeflachten Tubulusepithel (FL) und körnige Zylinder (Pfeile) in atrophischen Tubuli (ω). ). Maßstabsleiste: 100 µm. b Dynamische Bewertung der PT-S1-Albumin-Wiederaufnahme über die Zeit (n = 80, 40, 28 und 22 für Schein-, unverletzte, wiederhergestellte und atrophische Tubulussegmente von 3 Schein- und 4 Teil-IRI-Mäusen); Mittelwert ± 95 % KI mit Streudiagramm. Statistischer Test: lineares Mixed-Effect-Modell, p-Werte aus zweiseitigem Test (Supplementary Extended Statistics.p). c, d Volumetrische Quantifizierung von PI+-Kernen (% der Gesamtkerne/Segment) am Tag 0 (aus Tubuli mit >1 % PI+) (c) und GFP+-Kernen (% der Gesamtkerne/Segment) am Tag 3/4 (d) , in wiederhergestellten bzw. atrophischen Tubulussegmenten (c: n = 89 bzw. 92 Segmente von 4 bzw. 3 Mäusen; d: n = 124 bzw. 168 Segmente von 4 Mäusen); Mittelwert ± 95 % KI mit Streudiagramm. Statistische Tests: lineares Mixed-Effect-Modell, p-Werte aus zweiseitigem Test (Supplementary Extended Statistics.q). e Korrelative In-vivo- und Ex-vivo-2-Photonen-Mikroskopiebilder von CycB1-GFP-Nieren 21 Tage nach der partiellen IRI zeigen eine selektive tubuläre VCAM-1-Immunfärbung (blau, Pfeile) in atrophischen Tubuli (ω). Maßstabsleiste: 100 µm. f, g Tubular Fate Distribution (%) über partielle IRI-Bereiche (f: n = 82.232 und 153 Segmente für Nicht-IR, Mid und IR von 4, 6 bzw. 5 Mäusen) und Tage nach partiellem IRI (g: n = 103 und 106 für wiederhergestellte bzw. atrophische Tubuli von 6 Mäusen). h Binäre Regression der luminalen Granulargussfläche (in % der gesamten Segmentquerschnittsfläche) am Tag 3/4 und dem jeweiligen Tubulusschicksal (0 = keine Atrophie; 1 = Atrophie), (n = 237 Segmente von jeweils 4 Mäusen). ). Fit (Steigung*x + Achsenabschnitt); R2 und die Effektgröße als Odds Ratio (OR) für den Prädiktor werden angegeben. *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001.

Bei der Analyse der Verteilung von atrophischen, wiederhergestellten und unverletzten Tubulussegmenten über die verschiedenen partiellen IRI-Regionen stellten wir fest, dass sich die meisten atrophischen Tubuli (68 %) in der IR-Region entwickelten, in der sich nur 15 % der Tubuli erholten und 16 % unverletzt waren . In den mittleren Regionen wurden 14 % der Tubulussegmente atrophisch, 47 % erholten sich und 37 % blieben unverletzt. Nicht-IR-Regionen bestanden fast ausschließlich aus unverletzten Tubuli (97%) (Abb. 7f). Unter den nekrotischen Tubulussegmenten zeigten atrophische Tubuli am Tag 0 deutlich mehr Nekrose als sich erholende Tubuli (23,78 ± 1,54 %, n = 92 Segmente von 3 Mäusen vs. 13,29 ± 1,04 %, n = 89 Segmente von 4 Mäusen, p < 0,001). , Supplementary Extended Statistics.r), (Abb. 7c). Dennoch fehlten 30 % aller atrophischen Tubuli am Tag 0 jeglicher nekrotischer Zelltod. Interessanterweise befanden sich diese Tubuli typischerweise in unmittelbarer Nähe stark verletzter Tubulussegmente und waren stark von der Ansammlung von körnigem Gips betroffen (ergänzende Abbildung 7), was auf einen Zusammenhang mit nekrotischen Tubuli schließen lässt Tubulussegmente stromaufwärts. Wie oben gezeigt, war die Ansammlung von Granulatzylindern auch mit der Proliferation des zunächst nicht nekrotischen Tubulusepithels verbunden. Eine hohe Anzahl zyklischer Zellen ließ jedoch keine Wiederherstellung der Tubuli zu. Im Gegensatz dazu fanden wir eine signifikant höhere GFP-Expression (bewertet am Tag 3/4 nach der Reperfusion) in Tubuli, die atrophisch wurden, im Vergleich zu sich erholenden Tubuli (10,85 ± 0,94 % vs. 4,92 ± 0,54 %, n = 168 und 124 Segmente aus 4 Mäuse, p = 0,0065, Supplementary Extended Statistics.s). Daher haben wir als nächstes getestet, ob die Anhäufung von Granularzylindern eine Tubulusatrophie vorhersagt, indem wir die luminale Granulatzylinderfläche (in % der Gesamtquerschnittsfläche), die am Tag 3/4 eines Tubulussegments ermittelt wurde, und die Wahrscheinlichkeit einer Atrophie (0 = keine Atrophie) grafisch darstellten ; 1 = Atrophie), wie am Ende des Experiments bestimmt. Die binäre Regressionsanalyse ergab eine hochsignifikante Beziehung (p < 0,001; R2 = 0,81, Abb. 7h). Von den Tubuli mit schwerer und lumenfüllender Ansammlung von Granulatzylindern entwickelten 87 % eine Atrophie, während sich nur 13 % erholten (n = 131 Segmente von 4 Mäusen), was darauf hindeutet, dass Granulatzylinder dosisabhängig eine Tubulusatrophie vorhersagten. Im Gegensatz dazu erholten sich Tubuli mit abgeflachtem und vereinfachtem Epithel (was eher auf ATI als auf ATN hinweist) größtenteils (62 %) und nur 38 % wurden atrophisch (n = 94 Segmente von n = 5 Mäusen).

Um eine mögliche Rolle atrophischer Tubuli beim AKI-CKD-Übergang zu untersuchen, führten wir eine Ex-vivo-Immunhistologie32 für VCAM-1 durch – einen kürzlich vorgeschlagenen Marker für die fehlgeschlagene Erholung des proximalen Tubulus11 (n = 3). Somit zeigte die korrelative Bildgebung desselben immungefärbten Nierengewebes wie zuvor in vivo (21 Tage nach der Reperfusion) eine epitheliale VCAM-1-Positivität selektiv in atrophischen Tubuli, während wiederhergestellte Tubuli in denselben Nieren VCAM-1-negativ blieben (Abb. 7e).

Die serielle intravitale Mikroskopie der Niere unter Verwendung der AIW-Technik ist ein leistungsstarker Ansatz zur Untersuchung struktureller und funktioneller Veränderungen in der Remodellierungsniere im Laufe der Zeit und basiert auf Längsschnittbeobachtungen14,29,32,33. In dieser Studie nutzten wir serielle intravitale 2PM der lebenden Mäuseniere, um Epithelschäden und Erholung in einem AKI-Modell zu untersuchen, das konzipiert wurde, um die Auswirkungen einer fokalen Verletzung auf unverletztes Nierengewebe zu verstehen. Erstens berichten wir über signifikante Unterschiede in der Anfälligkeit der PT-S1-, PT-S2- und DCT/CD-Nephronsegmente gegenüber postischämischen nekrotischen Verletzungen. Zweitens zeigen wir, dass nekrotische Epithelzellen größtenteils durch die Proliferation überlebender Nachbarzellen ersetzt werden. Drittens dokumentieren wir, wie der postischämische Verlust nekrotischer Zellen und die Ansammlung von luminalen Zelltrümmern (Körnerzylinder) eine Nierenschädigung aufrechterhalten und eine epitheliale Umgestaltung und Proliferation in stromabwärts gelegenen, zuvor nicht nekrotischen Tubulussegmenten initiieren. Viertens identifizieren unsere Daten eine hohe postischämische nekrotische Schädigung und die Ansammlung körniger Zylinder als starke Prädiktoren für die Entwicklung einer Tubulusatrophie und belegen die De-novo-Expression des proinflammatorischen und profibrotischen Proteins VCAM-1 in atrophischen Tubuli, was auf eine aktive Rolle von hindeutet diese Tubuluspopulation im AKI-CKD-Übergang.

In Übereinstimmung mit früheren Arbeiten13,34 identifizierte unsere Studie den proximalen Tubulus als Hauptort der postischämischen nekrotischen Verletzung. Während auf diesem Gebiet allgemein anerkannt ist, dass der proximale gerade Tubulus (PT-S3) den höchsten Grad an postischämischen Verletzungen erleidet, wird in den meisten verfügbaren Daten nicht zwischen PT-S1 und PT-S234,35 unterschieden, die funktionell sind werden als gleich angesehen und sind schwer voneinander zu trennen34. Wir und andere25,26,36 zeigen, dass PT-S1 und PT-S2 mithilfe von 14:00 Uhr zuverlässig voneinander unterschieden werden können. Im Gegensatz zu herkömmlichen Forschungstechniken ermöglichte uns unser serieller Bildgebungsansatz außerdem, die Schwierigkeiten bei der Klassifizierung verletzter proximaler Tubulussegmente weitgehend zu überwinden, da mehrere Zeitpunkte für die Segmentklassifizierung berücksichtigt wurden. Unsere Daten belegen eindeutig eine höhere Anfälligkeit für nekrotische Verletzungen in postischämischen PT-S1-Segmenten im Vergleich zu PT-S2. Während PTs hauptsächlich auf den aeroben Stoffwechsel angewiesen sind, um ihren Energiebedarf zu decken, kann die anaerobe Glykolyse in Situationen mit verringerter Sauerstoffverfügbarkeit für die Erhaltung der Lebensfähigkeit von entscheidender Bedeutung sein37. In Übereinstimmung mit unseren Erkenntnissen zeigte die Hemmung der mitochondrialen Atmung in isolierten perfundierten Rattennieren eine klare Hierarchie der PT-Segmentverletzung, wobei PT-S1 am anfälligsten war, gefolgt von PT-S2 und am wenigsten PT-S338. Aufgrund der unzureichenden Laserpenetration in das Nierengewebe25,39 konnten tief gelegene PT-S3-Segmente in unserer Studie nicht untersucht werden. Die erhöhte postischämische Nekrose von PT-S1 im Vergleich zu PT-S2 könnte durch eine geringere Fähigkeit von PT-S1, ATP durch Glykolyse zu erzeugen, erklärt werden. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese zeigten frühere Studien eine höhere Anfälligkeit von PT-S2 gegenüber der Hemmung des Glukosestoffwechsels als PT-S125,38.

Die Längsbildgebung und Analyse von Epithelschäden und -umgestaltung bei CycB1-GFP-Reportermäusen zeigte eine enge räumliche Beziehung zwischen nekrotischen und zyklischen Zellen. Innerhalb von 24 Stunden nach der postischämischen nekrotischen Verletzung vermehren sich überlebende Zellen in unmittelbarer Nähe nekrotischer Stellen. In Übereinstimmung mit einem höheren Grad an anfänglicher nekrotischer Schädigung bei PT-S1 war die Zellproliferation zu frühen Zeitpunkten (24 Stunden nach partieller IRI) bei PT-S1 am höchsten. Allerdings nahm die proliferative Aktivität in stromabwärts gelegenen Nephronsegmenten im Laufe der Zeit drastisch zu. Somit ergab die Korrelation räumlicher und zeitlicher Informationen von denselben Nierenzellen über mehrere Tage hinweg letztendlich, dass die Proliferation in PT-S1-Segmenten größtenteils auf benachbarte Zellen nekrotischer Stellen beschränkt war, während PT-S2- und DCT/CD-Segmente eine wachsende Population von Nierenzellen aufwiesen zirkulierende Zellen in weiter Entfernung von der anfänglichen nekrotischen Verletzung. Bemerkenswerterweise beobachteten wir, dass dieses Phänomen räumlich und zeitlich mit der vorangegangenen Ansammlung von Granulatzylindern im Lumen der jeweiligen Tubuli korrelierte. Die aufeinanderfolgende Bildgebung derselben Tubulussegmente über mehrere Tage hinweg zeigte deutlich das Auftreten von körnigen Zylindern an Stellen nekrotischer Verletzungen, die langsam stromabwärts in zuvor nicht nekrotische Tubulussegmente wanderten und dabei mit der epithelialen GFP-Expression zusammenfielen (Abb. 4b). Mithilfe eines zusätzlichen selektiven PT-S1-Verletzungsmodells haben wir außerdem gezeigt, dass dieses Phänomen auch in völlig gesunden PT-S2-Segmenten stromabwärts der Verletzungsstelle und ohne potenziell subletale Auswirkungen der Ischämie auf nicht-nekrotische Tubuli auftrat. Bemerkenswert ist, dass eine beschleunigte Epithelproliferation nicht mit einer erfolgreichen Genesung verbunden war (Zusatzfilm 1). Im Gegenteil, wir entdeckten eine höhere Anzahl zyklischer Zellen in Tubuli, die schließlich atrophisch wurden, als in denen, die sich erholten. Die erhöhte Wahrscheinlichkeit einer Tubulusatrophie bei erhöhter epithelialer Proliferationsaktivität kann überraschend sein. Dennoch zeigten unsere Daten einen linearen Zusammenhang zwischen dem anfänglichen Grad des Absterbens tubulärer nekrotischer Zellen und der Anzahl der danach entstehenden proliferierenden Tubuluszellen. Somit ging der erhöhten proliferativen Aktivität, die in atrophischen Tubuli beobachtet wurde, auch ein höherer Grad an Epithelnekrose und die Bildung von körnigen Zylindern voraus. In Übereinstimmung damit war die Ansammlung von Granulatzylindern nicht nur mit einer fortschreitenden Epithelproliferation verbunden, sondern sagte auch dosisabhängig die Entwicklung einer Tubuliatrophie voraus. Insgesamt deuten diese Beobachtungen auf eine bisher unterschätzte Rolle der frühen Nekrose des proximalen Tubulus bei AKI hin und belegen Hinweise auf eine wesentliche und schicksalbestimmende Verletzungsausbreitung entlang des Nephrons. Auch wenn diese Prozesse immer noch Programme zur Epithelreparatur initiierten, wurde letzteres schließlich bei Vorliegen einer zu schweren Epithelnekrose als erfolglos angesehen. Im Einklang mit dem Konzept der Nekrose-induzierten Verletzungsausbreitung in stromabwärts gelegene Nephronsegmente zeigten alte Licht- und Elektronenmikroskopiedaten von postischämischen Rattennieren eine Nekrose in den proximalen gewundenen Tubuli, während die proximalen geraden Tubulussegmente vollständig durch angesammelte Lumenbläschen blockiert waren35. Darüber hinaus wurden Membranbläschen und körnige Zylinderbildung während der AKI mit Tubulusobstruktion und -rückfluss in Verbindung gebracht34,35,40, was eine Tubulusatrophie begünstigen kann. Schließlich bildet der Membranbruch während des nekrotischen Zelltods Zelltrümmer und führt zur Extrazellularisierung sogenannter gefahrenassoziierter molekularer Muster (DAMPs), die Gewebeentzündungen und -verletzungen weiter vorantreiben können, ein Prozess, der allgemein als Nekroinflammation bezeichnet wird41.

Bemerkenswert ist auch, dass wir beobachteten, dass mäßig nekrotische PT-S1-Segmente später ohne klassische Anzeichen von ATN (z. B. Bildung von körnigem Zylinder) auftraten, sondern eher einen Phänotyp von ATI aufwiesen, mit vereinfachtem und verdünntem Epithel, dem die Bürstensaumauskleidung fehlte (Abb. 4a). Tag 2–3 und Abb. 7a Tag 3 Mitte). Da Biopsien von AKI-Patienten häufig eher Merkmale einer ATI aufweisen, wird die Rolle von ATN bei menschlicher AKI kontrovers diskutiert22,42. Unser Längsschnittansatz ermöglichte die Verfolgung derselben Nierentubuli über einen längeren Zeitraum und zeigte, dass einer ATI eine leichte bis mittelschwere Tubulusnekrose vorausgehen kann. Biopsien von AKI-Patienten werden nicht routinemäßig entnommen, sind in ihrer Anzahl begrenzt und werden zu heterogenen Zeitpunkten nach der Verletzung entnommen22, was es schwierig macht, die Rolle des nekrotischen Zelltods bei menschlichem AKI auszuschließen. Darüber hinaus ergab die Urinanalyse von AKI-Patienten schlammige braune Abdrücke mit zahlreichen Nierenepithelzellen, was auf ATN43 schließen lässt. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass mehr Patientenmaterial erforderlich ist, um die Rolle von ATN bei menschlichem AKI neu zu bewerten.

Eine fehlgeschlagene Tubulusreparatur kann ein Auslöser für den Übergang von AKI zu CKD sein. Mithilfe der korrelativen Ex-vivo-Histologie konnten wir eindeutig die tubuläre De-novo-Expression von VCAM-1 selektiv in atrophischen Tubuli nachweisen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Tubulusverletzungsmarkern wie Kim1 oder NGAL tritt die VCAM-1-Expression nicht während der Phase der akuten Verletzung auf, sondern beginnt zwischen dem 3. und 7. Tag nach der Reperfusion anzusteigen8,11, was auch der Zeitpunkt war, an dem in unserem Datensatz erstmals eine Tubulusatrophie beobachtet wurde (Abb. 7g). VCAM-1 ist ein kürzlich etablierter Marker für einen proinflammatorischen Zustand proximaler Tubuluszellen, der an der Aktivierung von Immunzellen und der profibrotischen Signalübertragung beteiligt ist11. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen stellte eine kürzlich durchgeführte Studie einen Zusammenhang zwischen der renalen VCAM-1-Expression und einer fortschreitenden Nierenatrophie her, die durch ein verringertes Nierengewicht nach AKI8 bestimmt wurde. Somit deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Tubulusatrophie möglicherweise mehr als nur einen inaktiven Tubuluszustand darstellt, weisen jedoch auf eine aktive Rolle dieser Population beim AKI-CKD-Übergang hin.

In dieser Studie zeigen wir wichtige Erkenntnisse darüber, wie Tubulusverletzungen mit der Umgestaltung und dem Schicksal der Tubuli zusammenhängen. Unsere Daten zeigen, dass die frühe Nekrose des proximalen Tubulus und die anschließende Verletzungsausbreitung eine Schlüsselrolle für das Schicksal des Tubulus und die Atrophieentwicklung spielen. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse auf ein mögliches therapeutisches Interventionsfenster innerhalb der ersten Tage nach AKI hin, um die Ausbreitung von Verletzungen und die Atrophie der Tubuli zu begrenzen.

Alle experimentellen Verfahren mit Tieren in dieser Studie wurden von den örtlichen Behörden (Inspektion für Tierversuche, Dänemark, Genehmigungsnummer: 2020-15-0201-00443) genehmigt und gemäß den ARRIVE-Richtlinien gemeldet. Die Reportermauslinie Tg(Pgk1-Ccnb1/EGFP)1Aklo (CycB1-GFP) wurde vom Jackson Laboratory gekauft (Stamm-Nr.: 023345) und in den Barriere-Tieranlagen der Abteilung für Biomedizin der Universität Aarhus gezüchtet. Wurfgeschwister wurden im Alter von 3 Wochen entwöhnt. Erwachsene Mäuse wurden in der präklinischen Forschungseinrichtung des Universitätskrankenhauses Aarhus und in der Tiereinrichtung der Abteilung für Biomedizin der Universität Aarhus untergebracht. Die Mäuse wurden in einem 12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus mit Ad-libitum-Zugang zu einer Standardnahrung (Nr. 1324, Altromin, Deutschland) und Wasser in 2–5 Wohngruppen in individuell belüfteten Käfigen (Technoplast-Modell GM500 oder GM9000) bei 21 ± gehalten 2 °C und 55 ± 10 % relative Luftfeuchtigkeit. Die Einstreu bestand aus Espenholz der Größe 2–3 mm (Einstreu Midi, Abedd, Lettland) und komprimierten Baumwollschläuchen zum Nisten, und die Heimkäfige waren mit Mäuseiglus mit Spinnrädern, hölzernen Kaustangen, Pappschläuchen und Hirtenhütten ausgestattet. Die Käfige wurden routinemäßig einmal pro Woche gereinigt.

Für partielle IRI-In-vivo-Experimente wurden männliche und weibliche Mäuse mit einem Durchschnittsgewicht von 26,9 ± 0,8 g und einem Alter von 17,7 ± 2,3 Wochen (Mittelwert ± SEM) verwendet. Das Studiendesign ist in der Ergänzungstabelle 4 zusammengefasst. Der Geschlechtervergleich wurde im ursprünglichen Studiendesign nicht berücksichtigt und n-Zahlen erlauben keine endgültigen Schlussfolgerungen. Da AKI bei männlichen Probanden schwerwiegender ist44, haben wir hauptsächlich Daten von männlichen Tatverdächtigen gesammelt (n = 21 Männer und n = 5 Frauen). Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip der folgenden Behandlung zugeteilt: (1) partielle Ischämie-Reperfusionsverletzung (partielle IRI) und (2) Scheinkontrolloperationen. Für beide oben genannten Gruppen wurden zwei Versuchsprotokolle an getrennten Probanden durchgeführt: serielle intravitale Bildgebung (11 Teil-IR, 3 Scheinuntersuchungen) und GFR-Messung bei sich frei bewegenden Mäusen (8 Teil-IRI, 4 Scheinuntersuchungen). Innerhalb der Teil-IR-Bildgebungsgruppe wurden n = 6 Mäuse dem kurzfristigen seriellen Bildgebungsprotokoll (Bildaufnahme am Tag 0, 1, 2, 3 nach Teil-IR) und n = 5 Mäuse dem Langzeit-Bildgebungsprotokoll (Bildaufnahme) zugewiesen Erwerb am Tag 0, 3, 4, 7, 14, 21 nach teilweiser IR). Teilweise IRI-Mäuse wurden in die Studie einbezogen, nachdem die zeitliche Einschränkung und die anschließende Wiederherstellung des Blutflusses in etwa der Hälfte des Nierengewebes visuell bestätigt wurden (wie in Abb. 1a, d dargestellt). Partielle IRI-Mäuse wurden von der Studie ausgeschlossen, wenn die falsche Platzierung des Abdomen-Bildgebungsfensters die Identifizierung mittlerer oder IR-Regionen mittels intravitaler Mikroskopie nicht ermöglichte.

Eine Verblindung der experimentellen Behandlung konnte in unserem Design nicht durchgeführt werden, da die Validierung des erwarteten chirurgischen Ergebnisses eine genaue mikroskopische Untersuchung während der Operation erforderte.

Zur Bestätigung der zuverlässigen PT-S1- und PT-S2-Klassifizierung wurden vier 10 Wochen alte männliche C57/Bl6-Mäuse verwendet. Für Experimente mit selektiver laserinduzierter PT-S1-Verletzung wurden sieben 8,7 ± 1,1 Wochen (Mittelwert ± SEM) alte männliche CycB1-GFP-Mäuse verwendet.

Die chirurgischen Vorbereitungen bestanden aus zwei Verfahren: Induktion von AKI über ein für diese Studie entwickeltes partielles IRI-Modell und Implantation eines Abdominal Imaging Window (AIW), das gleichzeitig über der verletzten und unverletzten Seite der Niere platziert wurde (Abb. 1d) für die serielle intravitale Mikroskopie . Das AIW-Implantat wurde hergestellt, indem ein 12 mm dickes Deckglas mit Cyanacrylatkleber auf die Oberseite eines Implantats geklebt wurde, das aus zwei dünnen Titanringen (14 mm Durchmesser) bestand, die durch eine 1,5 mm breite Rille getrennt waren32,45,46,47.

Mäuse wurden mit Isofluran (3,5 % zur Einleitung, 1,5–1,75 % zur Erhaltung, 1,2–1,8 l/min Flussrate, 50 % Sauerstoff in medizinischer Luft) anästhesiert, erhielten Buprenorphin (0,1 mg/kg KG, Temgesic) per ip-Injektion und wurden auf ein 37 ± 0,5 °C warmes Heizkissen mit Rektalthermometer (hB101/2, Harvard-Gerät, Cambridge, MA, USA) gelegt. Augensalbe verhinderte die Austrocknung der Hornhaut. Die linke Flanke der Maus wurde rasiert und mit Chlorhexidin (0,5 % in 70 % Ethanol) desinfiziert, und ein 1 cm großer dorsoventraler Einschnitt wurde an der Mittellinie zwischen dem Brustkorb und dem linken Knie vorgenommen. Die linke Niere wurde durch Manipulation des Bindegewebes vorsichtig neu positioniert, sodass ihre ventrale Oberfläche in der Mitte des Einschnitts geschlitzt war. Nach sorgfältiger Dissektion des Bindegewebes wurde die Arteriengabelung am Stiel freigelegt (Abb. 1a, d) und der rechte Arterienast mit einem 6-0-Seidenfaden 21 Minuten lang verschlossen, während Temperatur und Flüssigkeitszufuhr der Niere aufrechterhalten wurden ein Spongostan-Schwamm (Ethicon), der kontinuierlich mit 36,5 °C warmer Kochsalzlösung gespült wird. Nach der Reperfusion wurde die die Niere umgebende Bauchdecke mit einer Tabaksbeutelnaht an die Haut genäht, um eine AIW-Implantation (Abdominal Imaging Window) durchzuführen. Mit 10 μl Cyanacrylatkleber wurde die Niere auf das AIW-Implantat geklebt. Durch die sorgfältige Platzierung des AIW über der Niere wurde sichergestellt, dass postischämische und nicht-ischämische Gewebebereiche zugänglich waren (Abb. 1d). Schließlich wurde die Haut um die Rille des AIW herum durch Festziehen der Tabaksbeutelnaht gesichert32,46. Anschließend wurden 10 μl/g KG sterile Kochsalzlösung zur Flüssigkeitsergänzung ip injiziert. Die postoperative Analgesie bestand aus 1–3 mg/kg KG Meloxicam sc, verabreicht nach der Operation, und gleichen Dosen Meloxicam und Temgesic einmal täglich für die zwei Tage nach der Operation. Die Mäuse erholten sich vor der ersten Bildgebungssitzung zwei Stunden lang in einer beheizten Kammer.

Um den Einfluss der partiellen IRI auf die Nierenfunktion zu charakterisieren, haben wir die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) transkutan über 7 Wochen bei frei beweglichen Scheinmäusen (n = 4) und partiellen IRI-Mäusen (n = 8) mithilfe der transkutanen GFR-Überwachung (Medibeacon, Deutschland) gemessen. 48. Kurz gesagt, die Mäuse wurden mit Isofluran (3,5 % Induktionsdosis) anästhesiert und mit Enthaarungscreme gründlich rasiert. Anschließend wurde ein miniaturisierter Fluoreszenzdetektor (Medibeacon, Deutschland) an die Rippen des Tieres geklebt und ein FITC-konjugiertes Inulinanalogon, Sinistrin, durch retroorbitale Injektion verabreicht (5 mg/100 g Körpergewicht; Medibeacon). Isofluran wurde abgesetzt und die Maus durfte aufwachen. Die Messung dauerte 90 Minuten. Die GFR wurde als Clearance-Rate von FITC-Sinistrin gemäß der Gebrauchsanweisung unter Verwendung des 3-Kompartiment-Modells analysiert.

Die Albuminurie wurde als Albumin/Kreatinin-Verhältnis in Punkturinproben49,50 und über einen Zeitraum von 4 Wochen (n = 3 Schein- und n = 4 partielle IRI) beurteilt. Nach der Sammlung wurde der Urin bis zur Analyse bei –80 °C eingefroren. Der Albumin- und Kreatiningehalt im Urin wurde mit einem im Handel erhältlichen Mausalbumin-ELISA-Kit (Nordic Biosite, Produkt-Nr. E99-134) bzw. einem Kreatinin-Urinnachweiskit (Thermo Fisher, Produkt-Nr. AIACUN) analysiert.

Wir führten bis zu drei Wochen lang eine serielle intravitale Mikroskopie durch, um die Dynamik einzelner tubulärer Epithelzellen im Zeitverlauf bei Schein- und Teil-IRI-Mäusen zu verfolgen. In vivo 2PM wurde unter Verwendung eines kohärenten Chamelion Ultra II-Lasers und eines Ultima Investigator Plus-Multiphotonenaufbaus (Bruker Corporation, Billerica, MA, USA) mit der PraireView IV-Software in aufrechter Objektivkonfiguration (20X Olympus XLUMPLFLN-Objektiv, Wasserimmersion, 1,00 NA, 2,0) durchgeführt mm WD). Die verwendeten Anregungswellenlängen waren 750 nm und 940 nm. Das Emissionssignal wurde nach einem 720sp-Filter auf 3 GaAsP-Photomultipliern (Hamamatsu, H7422-40) erfasst (Ch1: λet = 595/50 nm, Ch2: λet = 525/50 nm, Ch3: λe t = 460/50 nm). Darüber hinaus verwendeten wir ein aufrechtes Olympus FVMPE-RS 2-Photonen-Mikroskop (Olympus, Japan) mit Fluoview FV31S-Software (Olympus, Japan), das mit einem MaiTai HP DS-OL-Anregungslaser (Spectra Physics, USA), XLPLN25xWMP2, ausgestattet war Objektiv, Wasserimmersion (Olympus, Japan, NA 1,05; WD 2,00 mm) und die folgenden Detektionswürfel: Ch1: λet = 610/70 nm (Multialkali-PMT), Ch2: λet = 540/40 (GaAsP), Ch3: λet = 480/40 (GaAsP).

Vor der Bildgebung wurden die Mäuse mit Isofluran (gleiche Induktionsdosis der Operation) und 10 μl Propidiumiodid (PI, 0,25 mg/ml, Thermo Fisher) und 1 μl/g BW eines 2,5 mg/ml konjugierten Albumin-Alexa Fluor anästhesiert 594 Farbstofflösung (Alexa594-Albumin, Invitrogen) wurden retroorbital injiziert. PI ist ein geladener DNA-interkalierender Farbstoff, der aufgrund einer beeinträchtigten Membranintegrität spezifisch in nekrotische Zellen eindringt51. Zur Bestätigung der PT-S1/PT-S2-Segmentklassifizierung wurde an FITC konjugiertes 4-kDa-Dextran als Bolus durch die Schwanzvene injiziert (10 μl/Bolus einer 40 mg/ml-Lösung in PBS).

Für die serielle Bildgebung wurde das AIW-Implantat in einen maßgeschneiderten 3D-gedruckten Bildgebungsrahmen eingesetzt, der für Bildstabilisierung auf einem aufrechten Mikroskopaufbau sorgt52. Während der Bildgebung wurden Anästhesie und Temperatur mit einem Isofluran-Verdampfer mit geringem Durchfluss (30–50 ml/min, 1,2–1,5 %) (SomnoSuite, Kent Scientific) aufrechterhalten, der mit einer Heizdecke unter dem Tier ausgestattet war.

Zunächst haben wir einen vollständigen Atlas der AIW-angebrachten Nierenoberfläche bei einer Anregungswellenlänge von 750 nm erstellt, der die Gewebenavigation während aufeinanderfolgender Bildgebungssitzungen ermöglichte. Wir identifizierten Bereiche mit intensiver Nekrose durch eine Kombination aus kernspezifischem PI-Signal und einer sichtbaren Verringerung der tubulären epithelialen Autofluoreszenz, die im blauen Spektrum bei einer Anregungswellenlänge von 750 nm emittiert wird25. Bei Mäusen, die sich einer partiellen IRI unterzogen, identifizierten wir drei reproduzierbare Regionen (Abb. 1e): (1) durch ischämische Reperfusion geschädigtes Gewebe (IR-Regionen); (2) Grenzregionen rund um die ischämische Seite mit einem begrenzten Ausmaß an Nekrose (mittlere Regionen); (3) unverletztes Gewebe, Nicht-IR-Region). Bei Scheinmäusen wurde das gesamte Gewebe als Nicht-IR-Region klassifiziert.

Als nächstes haben wir 4–8 Sichtfelder (Field-of-Views, FOV) über dem Atlas in den drei Regionstypen lokalisiert. Wir haben jedes FOV mit zwei Anregungswellenlängen über drei Emissionskanäle (oben beschrieben) mit der folgenden Aufnahmesequenz abgebildet: (1) 940-nm-Anregung, Einzelbild in 20–30 μm Tiefe von der Nierenkapsel, definiert als Mittelpunktabschnitt des FOV ( 1024 × 1024, Verweilzeit: 3,2 μs, Galvo-Aster-Scan); (2) 940-nm-Anregung, 60 μm tiefe volumetrische Reihe im Bereich von –30 bis +30 μm vom FOV-Mittelpunkt (512 × 512, Verweilzeit: 2,4 μs, Galvo-Rasterscan, 1 μm Schrittgröße); (3) und (4), identische Parameter von (1) und (2) nach Änderung der Anregungswellenlänge auf 750 nm; (5) motorisierte Rückkehr in die Mitte des Sichtfelds, um eine mögliche Fehlplatzierung einzelner tubulärer Zellen während der Erfassung zu beurteilen. Die Laserintensität wurde so kalibriert, dass sie am Ziel einen Bereich von 20–35 mW Laserleistung liefert. Der verwendete Zoomfaktor lag zwischen 1 und 2,5X. Die Erfassungssequenz wurde als PraireView-Skriptfunktion eingebettet, um Benutzerfehler zu minimieren.

Zur Bestätigung der PT-S1/PT-S2-Segmentklassifizierung wurde ein Zeitraffer von 13,7 Hz während der iv-Bolusinjektion von 4 kDa-Dextran, konjugiert an FITC, aufgezeichnet.

Zur selektiven Verletzung von PT-S1-Segmenten verwendeten wir den 2-Photonen-Laser als Mikromanipulator14,28,29,30,31, um definierte Zellen in einem einzelnen PT-S1-Segment innerhalb eines Sichtfelds selektiv abzutragen. Daher haben wir durch wiederholte Linienscans (Pixelverweilzeit: 4 µs/Pixel) über das ausgewählte Tubulusepithel unter Verwendung einer 750-nm-Anregung gezielt etwa 35 benachbarte PT-S1-Tubuluszellen gezielt anvisiert. Anschließend wurden Mäuse in den folgenden drei Tagen täglich fotografiert, um Umbauprozesse innerhalb der verletzten und der umgebenden unverletzten Tubulussegmente zu untersuchen. Parallel dazu wurden Kontroll-FOVs in entfernter Entfernung zur Laserverletzung erfasst. Vor jeder Bildsitzung wurden den Mäusen PI und Alexa594-Albumin verabreicht, wie oben beschrieben.

Wir führten eine manuelle Bildanalyse und Zellzählung bei volumetrischen Scans unter Verwendung von FIJI53 Bio-Formats und BIOP Multi-Stack-Montage-Plugins54 durch. Die beiden Anregungsspuren für jede Bildsequenz wurden mithilfe von BIOP-Multi Stack Montage zu einem einzigen zusammengesetzten Bild zusammengeführt (ergänzende Abbildung 3). Die Zuweisung von Pseudofarben in zusammengeführten Bildern erfolgte, um eine ordnungsgemäße Anzeige zusammengeführter Bilder zu gewährleisten, wie in der ergänzenden Abbildung 3 ausführlich beschrieben. Das Signal in jedem vollständigen Einzelkanal wurde durch Kontrastverstärkung (Histogramm angepasst durch Sättigung von 0,35 % der Bildpixel) angepasst, um dies zu gewährleisten ordnungsgemäße Visualisierung jedes einzelnen Kanals in den zusammengesetzten zusammengeführten Bildern. Auf die vollständigen Display-Lookup-Tabellen (LUT) jedes Bildkanals kann im mit dieser Arbeit verknüpften Bild-Repository zugegriffen werden (https://doi.org/10.5061/dryad.vq83bk3z8).

Die quantitative Bewertung der Fluoreszenzintensitätssignale erfolgte an unverarbeiteten Bildern. Aus jedem in dieser Studie enthaltenen volumetrischen Scan haben wir die folgenden quantitativen Informationen für jedes einzelne epitheliale Tubulussegment extrahiert (Anzahl der Segmente für jeden Aufzeichnungstag und jede Gruppe, zusammengefasst in der Ergänzungstabelle 4): (1) Segmentidentität (proximaler Tubulus (PT) S1 und S2 sowie distale gewundene/Sammelkanaltubuli (DCT/CD), die wir anhand morphologischer Unterschiede und Rohintensitäten der FAD- und NADH-Autofluoreszenz und ihres Verhältnisses klassifiziert haben (Abb. 2a – c). Von 875 partiell analysierten Tubulussegmenten 8,7 % der IRI-Mäuse waren nicht klassifizierbar. (2) Maximale röhrenförmige Querschnittsfläche (µm2). (3) Anzahl der Gesamtkerne/Segment. (4) Anzahl der PI+-Kerne und (5) Anzahl der GFP-exprimierenden Zellen pro Segment Die Gesamt-, PI+- und GFP+-Kernzahlen wurden in 3D bewertet: Die Kernzählung erfolgte volumetrisch unter Verwendung der Zählung von 5 Ebenen über ein 25-µm-Volumen, das jedes analysierte Segment von oben bis unten abdeckte. Tubuluskerne wurden aus dem stark blauen Zytosol ausgeschlossen Die Autofluoreszenz der Tubuli wurde bei 750-nm-Anregung aufgezeichnet und war somit eindeutig als negativ gefärbte Objekte in einzelnen Tubuluszellen identifizierbar (ergänzende Abbildung 3). Die Quantifizierung der Anzahl der PI+-Kerne wurde basierend auf der starken roten Kernemission in nekrotischen Zellen in 750-nm-Track-Daten durchgeführt (ergänzende Abbildung 3). Die GFP-Quantifizierung wurde auf der Grundlage von 940-nm-Anregungsspurdaten durchgeführt, die für die GFP-Anregung optimal sind55 und eine klare Trennung des GFP-Signals von der Autofluoreszenz des Tubulusepithels bzw. vom Granulatgusssignal ermöglichen (ergänzende Abbildung 3). Für die GFP-Zählung wurde eine spezielle Untergruppe für Zellen erstellt, die sich am Tag 0 in einem Radius von ~25 µm um jede nekrotische Zelle proliferierten. (6) Die Menge der körnigen Zylinder (Zelltrümmer) im Tubuluslumen wurde als Bereich mit festem Lumeninhalt bewertet über die Querschnittsfläche in der Ebene des größten Tubulusdurchmessers. (7) Morphologische Klassifizierung des tubulären Umbauzustands: abgeflachtes vereinfachtes Epithel (akute Tubulusverletzung), körnige Zylinder (akute Tubulusnekrose) und atrophischer Tubulus wurden für jeden Tag seit der Operation im Langzeitdatensatz durchgeführt; (8) Die Einstufung des Schicksals des Tubulussegments als vorgetäuscht, unverletzt, genesen oder atrophisch basierte auf der morphologischen Beurteilung am Ende des Experiments (Tag 14 oder Tag 21 des Langzeitdatensatzes). Die Scheinuntersuchung umfasste röhrenförmige Segmente von Scheinkontrollen. Nicht-nekrotische Segmente wurden am Tag 0 als PI-negativ definiert, die über die Zeit funktionell und morphologisch erhalten blieben. Wiederhergestellte Segmente wurden am Tag 0 als PI+ definiert (>1 % der gesamten Zellkerne), die morphologisch intaktes Epithel wiedererlangten. Atrophische Segmente wurden durch ein kollabiertes tubuläres Lumen und ein stark fragmentiertes epitheliales Erscheinungsbild definiert (ergänzende Abbildung 2). (9) Die dynamische PT-S1-Funktion wurde als Albumin-Wiederaufnahmekapazität bewertet, ausgedrückt als mittleres Fluoreszenzintensitätsverhältnis von Alexa594-Albumin in der apikalen zytoplasmatischen Region von PT-S1-Segmenten und in peritubulären Kapillaren (n = 170).

In Fällen, in denen die Neuidentifizierung einzelner FOVs zu einem beliebigen Erfassungszeitpunkt fehlschlug, fehlten serielle Daten zu den jeweiligen Zeitpunkten und konnten nicht in die weitere Analyse einbezogen werden. Die angezeigten Daten geben n Zahlen für analysierte Tubulussegmente bzw. Versuchsmäuse an.

Zur Bestätigung der PT-S1/PT-S2-Segmentklassifizierung wurden Bolus-Tracking-Zeitrafferaufzeichnungen von iv injiziertem, an FITC konjugiertem 4-kDa-Dextran analysiert, indem luminale interessierende Regionen (ROIs) in vordefinierten PT-S1- und PT-S2-Segmenten platziert wurden. S2-Segmente. Die FITC-Fluoreszenzintensität im grünen Lichtspektrum (λem = 525/50 nm) wurde aus ROIs extrahiert und über die Zeit aufgetragen.

Rohdaten wurden gesammelt und in Microsoft Excel v. 2305 zur weiteren statistischen Analyse zusammengestellt, wie unten beschrieben.

Die Bildverarbeitung erfolgte mit der kürzlich veröffentlichten „Intravital Microscopy Processing Toolbox for FIJI“52 unter Verwendung der folgenden Funktionen:

Die Entrauschung der Stapel wurde mit der Varianzstabilisierungstransformation (VST)56 BM4D34 in MATLAB v. 2022a (Mathworks) durchgeführt. Zunächst wurde die Standardabweichung des Rauschens (Sigma) an fünf separaten Bildern mit dem Algorithmus von Liu et al.57 im mittleren und letzten Frame des Gesamtstapels geschätzt und dann zu einem einzigen Wert gemittelt. Zweitens wurde dann ein verallgemeinertes Anscombe VST56 auf die Daten angewendet. Nach der Anwendung des VST wurde der Stapel in 10 Frame-Blöcke aufgeteilt, die sich an jedem Ende um 5 Frames überlappten, und dann parallel mit dem BM4D-Rauschunterdrückungsfilter verarbeitet. Schließlich wurden BM4D-verarbeitete Blöcke zu einem einzigen Stapel zusammengefügt und ein geschlossener inverser Anscombe VST [36] angewendet, um den endgültigen entrauschten Stapel zu erhalten.

Mithilfe des FIJI-Plugins BigWarp und einer starren Rotationstransformation wurden Bildstapel registriert, um die Visualisierung der entsprechenden Fokusebenen bei stärkerer Ischämie-induzierter Gewebeumgestaltung zu verbessern58. Der Tag-0-Stapel jedes FOV wurde als Zielbild zur Verwendung als Referenz festgelegt, Orientierungspunkte wurden manuell auf Follow-up-Daten zu entsprechenden Strukturen platziert. Der Vorgang wurde wiederholt, bis die Ausrichtung visuell als erfolgreich beurteilt wurde.

Nach dem letzten Experiment wurden die Mäuse zur Gewebeentnahme und anschließenden Immunhistologie mit Isofluran anästhesiert und mit 4 % PFA perfusionsfixiert.

Die Nieren wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in 4 % PFA nachfixiert und dann zur Einbettung von gefrorenem Gewebe oder zur Ex-vivo-Korrelationsmikroskopie verarbeitet. Zur Einbettung von gefrorenem Gewebe wurden die Nieren in 30 % Saccharose/PBS gelegt, bis sie auf den Boden sanken, in Tissue-Tek OCT-Compound (Sakura, USA) eingefroren und schließlich bei –80 °C gelagert. Für die korrelative Ex-vivo-Mikroskopie wurden die Nieren sofort nach dem unten beschriebenen Färbeprotokoll verarbeitet.

Korrelative Mikroskopie von ungefärbten, HE- und PAS-gefärbten gefrorenen Nierenschnitten: 6 µm dicke gefrorene Schnitte aus postischämischem Gewebe (n = 3 Nieren) wurden in Serie geschnitten und entweder mit Hämatoxylin und Eosin (HE), Periodsäure-Schiff, gefärbt (PAS) oder ungefärbt gelassen werden. HE- und PAS-gefärbte Schnitte wurden auf einem Leica-Lichtmikroskop abgebildet, und ungefärbte gefrorene Schnitte wurden auf einem Olympus FVMPE-RS 2-Photonen-Mikroskop mit 750-nm-Anregung und den folgenden Detektionswürfeln abgebildet: Ch1: λet = 570/30 nm, Ch2: λet = 503/35 nm, Ch3: λet = 452,5/22,5 nm. Dieselben Tubulussegmente wurden auf HE-, PAS-gefärbten bzw. ungefärbten Schnitten lokalisiert, um zu vergleichen, wie unterschiedliche Remodellierungsereignisse über 2PM erkannt wurden, die in HE- bzw. PAS-gefärbtem Gewebe angezeigt wurden. Ein erfahrener Pathologe überprüfte die Bildserie und klassifizierte verschiedene Umbauereignisse, wie in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt.

Korrelative Ex-vivo-Mikroskopie von VCAM-1-immungefärbtem Nierengewebe: Der kortikale Nierenbereich, der mit dem AIW verbunden war, wurde als 1–2 mm dicker Gewebeschnitt abgetrennt. Das gewonnene Gewebe wurde zweimal 15 Minuten lang in PBS gewaschen und anschließend 1 Stunde lang in 1 % BSA/2 % SEA BLOCK/0,1 % Triton X-100/PBS blockiert. Der primäre Kaninchen-Anti-VCAM-1-Antikörper (Abcam AB0134047, 1:200)12 wurde 72 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurde der Sekundärantikörper Donkey Anti-Rabbit Alexa 405 (Jackson ImmunoResearch 711-175-152, 1:500) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurde der Gewebeschnitt zwischen zwei durch einen 1–2 mm dicken Abstandshalter (SunJim Lab) getrennten Deckgläsern in PBS eingebettet und auf einem Olympus FVMPE-RS 2-Photonen-Mikroskop abgebildet. Die gleichen Geweberegionen, die in vivo abgebildet wurden, wurden anhand von Gewebemarkierungen wie erkennbaren Tubulusformen und Fluoreszenzmustern identifiziert32. Die Bilder wurden bei einer Anregungswellenlänge von 800 nm aufgenommen und die Emission wurde mit den folgenden Detektionswürfeln erfasst: Ch1: λet = 570/30 nm, Ch2: λet = 503/35 nm, Ch3: λet = 452,5/22,5 nm. Antikörpervalidierung: Die Spezifität von Kaninchen-Anti-VCAM-1 (Abcam AB0134047) für die Immunhistologie in Mausgewebe wurde vom Hersteller mithilfe der Knockout-Validierung und Mausmilzgewebe als Positivkontrolle validiert. Die Eignung von Kaninchen-Anti-VCAM-1 zur Identifizierung von Zellen mit fehlgeschlagener Tubulusreparatur wurde bereits für Maus- und menschliches Gewebe nachgewiesen11,12. Eine unspezifische Färbung von Donkey anti-Rabbit Alexa 405 (Jackson ImmunoResearch 711-175-152) wurde durch die Durchführung des gleichen Färbeprotokolls ohne Primärantikörper-Inkubation ausgeschlossen.

Zur Bestätigung der selektiven GFP-Expression in proliferierenden Zellen injizierten wir 4 Tage lang täglich 1 μl/g KG EdU (1 mg/ml in sterilem PBS, Invitrogen C10424) ip in 3 CycB1-GFP-Mäuse. Zur Aufzeichnung der GFP-Expression im Zeitverlauf wurde eine tägliche serielle Messung um 14:00 Uhr verwendet. Am 4. Tag wurden die Mäuse wie oben beschrieben perfusionsfixiert und die Nieren nachfixiert. Die Visualisierung von in vivo injiziertem EdU auf fixiertem Gewebe wurde mit einem Click-iT Edu Flow Assay Cytometry Assay Kit Alexa Fluor 647 (Invitrogen, C10424) durchgeführt. Die Proben wurden zweimal 15 Minuten lang in PBS bei 300 U/min und 20 °C in einem Eppendorf Thermomixer gewaschen, gefolgt von einer Permeabilisierung in PBS mit 0,5 % Triton X-100 für 15 Minuten bei 300 U/min und 20 °C. Anschließend wurden die Proben in einem modifizierten EdU-Reaktionscocktail inkubiert, wobei 1 % Triton x-100 zum PBS für 6 Stunden bei 20 °C und 300 U/min hinzugefügt wurde. Nach dem Färben wurde die Probe zweimal 5 Minuten lang in PBS bei 20 °C und 300 U/min gewaschen und bis zur Bildgebung in PBS bei 4 °C gelagert. Um die in vivo bestimmte GFP-Expression mit dem ex vivo sichtbaren EdU-Einbau zu korrelieren, führten wir eine korrelative Bildgebung derselben FOVs durch, die in vivo auf einem konfokalen Zeiss LSM710-Mikroskop (Zeiss, Deutschland) abgebildet wurden.

Für statistische Analysen verwendeten wir MATLAB v. 2022a (The Mathworks Inc.). Für Bilddaten wurden einzelne Tubulussegmente als statistische Einheiten betrachtet und jede Analyse bestand aus einer wiederholten Messung desselben Tubulus über einen bestimmten Zeitraum. Um mit fehlenden Datenpunkten und der heterogenen Anzahl von Proben bei verschiedenen Mäusen umzugehen, haben wir für jeden aus Segmentanalysen abgeleiteten Datensatz lineare Mixed-Effects-Modelle erstellt. Antwortvariablen und feste Effekte werden im Abschnitt „Erweiterte statistische Analysen“ in den Zusatzinformationen für jede Analyse angegeben. Ergebnisse aus linearen Regressionsanalysen werden wie folgt angegeben: lineare Gleichung (y = Steigung*x + Achsenabschnitt), R2-Anpassungsgüte und Effektgröße, geschätzt als Pearson-Korrelationskoeffizient. Prädiktoren und Gruppen werden in jeder Abbildungslegende angegeben. In den jeweiligen Streudiagrammen werden lineare Gleichungen angegeben, um statistische Vergleiche zwischen Steigungen und Achsenabschnitten als Auswirkung eines bestimmten Prädiktors hervorzuheben. Einzelne Tiersubjekte wurden als Zufallseffekte für alle linearen Mixed-Effects-Modelle verwendet. Die GFR- und Albumin/Kreatinin-Verhältnisse wurden mit einer gepaarten Zwei-Wege-ANOVA in Graph Pad Prism (gleiche Probandenzeit an verschiedenen Tagen angepasst) mit Bonferroni-Korrektur für mehrere Vergleiche analysiert. Quantitative Zahlen und zugehörige Statistiken wurden mit der Gramm Toolbox59 erstellt. Die Daten werden mit Mittelwert mit 95 %-KI in Zahlen und Mittelwert ± SEM im Text angegeben, sofern nicht anders angegeben. p-Werte werden wie folgt angegeben: */#: p < 0,05; **/##: p < 0,01; ***/###: p < 0,001. Detaillierte Informationen zu Teststatistiken finden Sie im Abschnitt „Erweiterte statistische Analysen“ in den Zusatzinformationen, die im Text als „Ergänzende erweiterte Statistiken“ bezeichnet werden und Folgendes umfassen: Für ANOVA- und Mixed-Effects-Modelle werden F-Werte mit Freiheitsgraden (F (DFn, DFd)) werden gemeldet. Für Unterschiede zwischen Gruppen (in T-Tests und individuellen Post-hoc-Gruppenschätzungsvergleichen aus linearen gemischten Modellen) wird die Schätzung des Modells für die Differenz zwischen den Gruppen (Δ) mit unteren/oberen 95 %-Konfidenzintervallen (95 %-KI [LL, UL]) und t-Werte mit Freiheitsgraden (t (df)) werden angegeben.

Intravitale Bildgebungsexperimente einzelner Versuchsmäuse wurden als unabhängige Experimente durchgeführt. Nachdem sichergestellt wurde, dass die Einschlusskriterien gegeben waren (erfolgreiche partielle IRI-Operation und korrekte Platzierung des abdominalen Bildfensterimplantats), konnten verschiedene partielle IRI-Regionen (Nicht-IR, Mittel und IR) basierend auf unterschiedlichen nekrotischen Zellschädigungsmustern am Tag 00 reproduzierbar identifiziert werden Die in dieser Studie beschriebenen biologischen Phänomene waren in allen Versuchsversuchen reproduzierbar.

Die Analyse des Albumin-Kreatinin-Verhältnisses aus Urinproben wurde als Doppelbestimmung durchgeführt. Die transkutanen GFR-Basismessungen wurden als Duplikate durchgeführt. Nach IRI/Scheinoperation wurden transkutane GFR-Messungen in Längsrichtung durchgeführt und somit als Einzelwerte pro Zeitpunkt und Tier ermittelt.

Repräsentative serielle In-vivo-2-Photonen-Bilder wurden aus Daten aus der folgenden Anzahl unabhängiger Experimente ausgewählt: Teil-IRI: Tag 0 = 8 Mäuse, Tag 1–2 = 4 Mäuse, Tag 3 = 8 Mäuse, Tag 4 = 4 Mäuse, Tag 7, 21 = 5 Mäuse; Tag 14 = 4 Mäuse; und Schein: Tag 0, 1, 2, 3, 4, 7, 14 = 3 Mäuse, Tag 21 = 2 Mäuse. Repräsentative korrelative In-vivo- und Ex-vivo-Bilder zur Klassifizierung von Umbauprozessen wurden aus Daten aus drei unabhängigen Experimenten ausgewählt. Repräsentative korrelative In-vivo- und Ex-vivo-Bilder zum Nachweis der VCAM1-Positivität in atrophischen Tubuli wurden aus Daten aus drei unabhängigen Experimenten ausgewählt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Rohdaten, die zur Generierung aller in diesem Dokument gezeigten Zahlen verwendet werden, werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Die in dieser Studie generierten Zwei-Photonen-Bildgebungsdaten wurden in der DataDryad-Datenbank hinterlegt: https://doi.org/10.5061/dryad.vq83bk3z8. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Alle Analysecodes, die für statistische Analysen und die Erstellung von Diagrammen in MATLAB verwendet werden, sind im Zenodo-Repository verfügbar: https://zenodo.org/record/7892132.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Associate Professor Rikke Nielsen für die fruchtbare und kritische Diskussion der Daten. Wir danken außerdem dem Center for Functionally Integrative Neuroscience und der Health Bioimaging Core Facility der Aarhus University für den Einsatz von bildgebenden Geräten und technischer Unterstützung. IMS hat Zuschüsse von der Novo Nordisk Foundation (NNF, Zuschussnummer: NNF19OC0054899) und der Aarhus University Research Foundation (AUFF, Zuschussnummer: AUFF-E-201 9-7-21) erhalten. LB wurde durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen von Marie Skłodowska-Curie gefördert (Fördernummer: 801133).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Luca Bordoni, Anders M. Kristensen.

Abteilung für Biomedizin, Universität Aarhus, Aarhus, Dänemark

Luca Bordoni, Anders M. Kristensen, Donato Sardella, Hanne Kidmose, Layla Pohl und Ina Maria Schiessl

GliaLab und Letten Centre, Abteilung für Anatomie, Abteilung für Molekulare Medizin, Institut für medizinische Grundlagenwissenschaften, Universität Oslo, Oslo, Norwegen

Luca Bordoni

Abteilung für Pathologie, Universitätsklinikum Aarhus, Aarhus, Dänemark

Søren Rasmus Palmelund Krag

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LB entwickelte das Krankheitsmodell und entwarf Bildgebungsexperimente, erfasste In-vivo-Bildgebungsdaten, analysierte Bilder, kuratierte den Datensatz, führte statistische Analysen durch, interpretierte die Daten und verfasste das Manuskript. AMK erfasste In-vivo- und In-vitro-Bildgebungsdaten, entwarf GFR-Experimente und erfasste GFR-Daten, analysierte Bilder, interpretierte die Daten und verfasste das Manuskript. DS entwickelte das maßgeschneiderte Setup für die In-vivo-Bildgebung, Bildanalysetools und das Bildverarbeitungsprotokoll. HK verarbeitete Ex-vivo-Proben, erfasste GFR-Daten, führte Immunhistochemie sowie Labor- und Mauskolonienmanagement durch. LP: Bilder analysiert und die Daten interpretiert. SRPK: Dateninterpretation. IMS konzipierte die Studie, überwachte die Studie, finanzierte die Arbeit, interpretierte die Daten und verfasste das Manuskript.

Korrespondenz mit Ina Maria Schiessl.

Die Autoren erklären die folgenden konkurrierenden Interessen: Zuschüsse wurden von der Novo Nordisk Foundation (IMS), der Augustinus Foundation (IMS), der Aarhus University Research Foundation (IMS) und dem Horizon 2020 Research and Innovation Program (LB) der Europäischen Union erhalten. Die übrigen Autoren geben keine weiteren Interessenkonflikte an.

Nature Communications dankt Andreas Linkermann und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bordoni, L., Kristensen, AM, Sardella, D. et al. Die Längsverfolgung einer akuten Nierenschädigung zeigt die Ausbreitung der Schädigung entlang des Nephrons. Nat Commun 14, 4407 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40037-y

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Eingegangen: 17. Januar 2023

Angenommen: 10. Juli 2023

Veröffentlicht: 21. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40037-y

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