Vergleich alternativer mAb-Reinigungstechnologien

Von Jack Vicalvi, leitender Wissenschaftler, J2 Biopharm Associates LLC

Wir haben in den letzten 15 Jahren mehr Verbesserungen bei der Entwicklung nachgelagerter Prozesse gesehen als in den 35 Jahren zuvor. Dies ist der erste Teil einer zweiteiligen Übersicht ausgewählter innovativer Produkte und Ansätze mit universellen Auswirkungen, die zu Verbesserungen beigetragen haben, die die Herstellung großmolekularer biologischer Therapeutika wie monoklonaler Antikörper (mAbs) und viraler Vektoren mit höherer Ausbeute und Reinheit ermöglichen.

In Teil 1 untersuchen wir, wie diese Produkte die Art und Weise verändern, wie wir mAbs herstellen, wo sie in aktuellen Prozessentwicklungsprogrammen eingesetzt werden können und welche Vorteile sie gegenüber früheren Methoden bieten. Wir gehen auf die Situationsökonomie ein, die den Einsatz dieser innovativen Produkte oder Ansätze vorantreibt. Schließlich konzentrieren wir uns aus praktischen Gründen auf GMP-Scale-up-Modelle: Wenn es nicht skalierbar ist, ist es egal, wie gut es sein mag.

mAb-Prozessflussdiagramme

Die Klärung der Bioreaktor-Ernte ist der erste Schritt im nachgelagerten Prozess; Dabei handelt es sich nicht um den letzten Schritt des vorgelagerten Prozesses, da es sich im Wesentlichen um die Reinigung der Arzneimittelsubstanz handelt. Dieser Schritt ist entscheidend für die effiziente Reinigung des gewünschten Produkts; Die einfache Größenfiltration des geernteten Materials ist die traditionelle Methode. Abhängig von den erforderlichen kritischen Qualitätsattributen (CQAs) ist die größenbasierte Filtration allein jedoch möglicherweise nicht mehr ausreichend oder unvermeidbar.

Die Verwendung von geladenen Filtergeräten (wie den 3M SP- und ZB-Filtern oder Millipore DOHC-, COHC- und (HCP) und Viren, wodurch die Effizienz der nachgelagerten Erfassung und damit die anfängliche Rückgewinnung und Reinheit deutlich verbessert wird. In Situationen, in denen die Lebensfähigkeit der Zellen während der Ernte gering ist (<50 %), kommt es zu einem deutlichen Anstieg der Wirtszelltrümmer, einschließlich DNA, HCP (einschließlich proteolytischer Enzyme) und intrazellulärer oder endogener Viruspartikel, wobei eine zusätzliche Reduzierung durch geladene Membranfiltration möglich ist werden bei nachfolgenden Reinigungsschritten von Bedeutung. In Situationen mit geringer Zelllebensfähigkeit würde die Zugabe einer Endonuklease, vorzugsweise im Bioreaktor, eine Stunde vor der Ernte dazu dienen, die DNA-Stranglänge zu reduzieren und die Filtrierbarkeit deutlich zu verbessern. Die Endonuklease arbeitet während der Klärung bis zum Einfangen weiter (normalerweise 3 bis 8 Stunden, abhängig von den Einfangbedingungen und der Ladegeschwindigkeit).

In den meisten Fällen binden mAbs nicht an anionische Matrizen; Es kann jedoch erforderlich sein, den pH-Wert und/oder die Leitfähigkeit der Ernte (wiederum vorzugsweise im Bioreaktor) abhängig vom interessierenden Ziel anzupassen, um eine Bindung an den Filter zu verhindern oder das Ziel für die Erfassung in nachfolgenden Schritten vorzubereiten. Die Bedingungen für eine optimale Produktrückgewinnung bei maximaler Reduzierung von Verunreinigungen müssen für jeden mAb empirisch ermittelt werden.

Wenn Tiefenfilter geeigneter Größe ausgewählt werden, wird die Zentrifugation bestenfalls überflüssig; Hinzu kommt das Problem der Skalierungs- und Reinigungsvalidierung, selbst bei Einwegeimern (Investitionskosten und Wartung der Ausrüstung, Aerosolerzeugung und Entsorgung gebrauchter Eimer). In den Fällen, in denen eine Filtration unpraktisch ist, könnte der Einsatz der Expanded-Bed-Chromatographie eine praktikablere und wirtschaftlichere Option sein (siehe Rhobust EBA-Technologie von Upfront).

Typischerweise wird im Einfangschritt ein Protein-A-Harz eingesetzt. Allerdings sind nicht alle Protein-A-Einheiten gleich. Einige binden verschiedene mAbs mit unterschiedlichem Grad an Spezifität und Avidität; Daher sollte jedes Protein-A-Harz, das Sie auswählen, empirisch bestimmt werden. Außerdem ist die Harzmatrix zu berücksichtigen; Dazu gehören weiche Harze wie Agarose und einige Methacrylate sowie starre Harze wie Polystyrol oder Keramik. Alle verfügen über umfangreiche behördliche Unterlagen.

Die Hauptunterschiede zwischen weichen und starren Harzen liegen in der Lineargeschwindigkeit und dem Pufferverbrauch während des Betriebs. Agarose ist ein weiches Harz, das eine Wandunterstützung erfordert, da sonst das Bett durchhängt und ein „Lächeln“ bildet, das während der Elution in Säulen mit einer Breite von mehr als 5 cm eine Vorderkante erzeugt. Es handelt sich außerdem um ein langsam diffundierendes Medium, das oberhalb von 300 cm/h an Kapazität und Bettintegrität verliert. Darüber hinaus erfordert es aufgrund seiner diffusiven Natur ein umfangreiches Waschen während des Pufferwechsels, insbesondere vor der Elution. Capto-Harze sind vernetzte Agarose, die einige dieser Probleme lindern kann; Allerdings handelt es sich bei der Grundmatrix immer noch um Agarose, was umfangreiches Waschen und langsame Flussraten erfordert, um eine Diffusion zu ermöglichen. Starre Harze lassen sich leichter verpacken, erfordern viel weniger Waschen und bewahren die Bettintegrität ohne Wandunterstützung. Diese Harze können auch bei linearen Geschwindigkeiten von 800 bis 1.200 cm/h ohne nennenswerten Produktivitätsverlust betrieben werden.

Eine kostengünstige Alternative zur Protein-A-Erfassung ist CIEX. Nach einer Einstellung des pH-Werts auf 6 im Bioreaktor vor der Klärung können die meisten mAbs mit einem Kationenaustauscherharz wie POROS HS oder Toyopearl GigaCap CM gebunden werden. Die CIEX-Harze haben auch eine viel größere Kapazität als Protein-A-Harze (obwohl die Selektivität geringer ist). Starre CIEX-Harze sind in der Lage, erhebliche Viren zu entfernen, wenn sie mit 450 bis 600 cm/h betrieben werden (3 bis 4 Log-Entfernung von Viren oder LRV). Nach der selektiven Elution des Ziels kann das Eluat für einen Schritt zum Halten eines niedrigen pH-Werts heruntergeregelt werden, wie im typischen Protein A-Schritt.

Eine weitere alternative Einfangmethode wäre Toyopearl MX-TRP-650M, das Tryptophan als Einfangligand verwendet. Andere Optionen wie Protein G und „Boutique“-Liganden sind deutlich teurer als Protein A und stellen insbesondere in GMP-Herstellungsszenarien ein höheres Risiko und höhere Kosten dar.

Tabelle 1.Vergleich der mAb-Capture-Schritte von weichem vs. starrem Harz vs. CIEX (starres Harz)

*Mab SelectSure bei 16.000 $/L = 380.000 $/Spalte x 2 (GMP-Backup) = 760.000 $ + Spalten (je 40.000–60.000 $).**Mab Capture A bei 10.000 $/L = 250.000 $/Spalte x 2 (GMP-Backup) = 500.000 $ + Spalten (jeweils 40.000–60.000 $).***Toyopearl GigaCap CM bei 6.000 $/L = 150.000 $/Spalte x 2 (GMP-Backup) = 300.000 $ + Spalten (jeweils 40.000–60.000 $).

Der traditionelle Ansatz besteht hier in der Verwendung von CIEX. Die oben dargelegten Überlegungen würden auch hier gelten. Bei dem alternativen Ansatz, bei dem CIEX als Einfangschritt verwendet wird, ist der erste mAb-Polierschritt normalerweise HIC, beispielsweise ein Phenyl- oder Butylharz. Am beliebtesten sind die Harze auf Methacrylatbasis von Tosoh. Diese Harze können mit höheren linearen Geschwindigkeiten betrieben werden als die auf Agarose basierenden Harze, im Allgemeinen 300 bis 600 cm/h. In diesem Schritt könnte ein gemischtes Modalharz wie CaptoAdhere, Capto MMC oder Hydroxy Apatite verwendet werden; Diese Harze können auch einen wesentlichen Beitrag zur Virusclearance leisten.

HIC-Säulen werden normalerweise mit dem CIEX-Eluat bei einer Leitfähigkeit von 30 bis 50 mS/cm (250 bis 400 mM NaCl) beladen und anschließend mit abnehmenden Leitfähigkeitsschritten gewaschen, eluiert und gestrippt. Einer der Unterschiede zwischen Agarose- und Methacrylatharzen ist die Tendenz von Agarose, sich in Gegenwart höherer Salze zusammenzuziehen und in Abwesenheit von Salz auszudehnen; Methacrylate und Hartharze nicht. Die Elution aus dem HIC bei physiologischem Salz kann auch durch Erhöhen des pH-Werts manipuliert werden. Damit wird der nächste Schritt im Prozess eingeleitet.

Die Tendenz besteht hier darin, eine AIEX-Spalte zu verwenden. Dieser Schritt wird als Durchfluss für den mAb durchgeführt, während die restlichen Verunreinigungen, die nach dem Einfangen und den ersten Polierschritten verbleiben, einschließlich HCP und DNA, entfernt werden, und er ist als wichtiger Schritt zur Virusentfernung wichtig. Normalerweise sind die verbleibenden Verunreinigungen sehr gering und abhängig vom Grad der verbleibenden Verunreinigungen kann die Säule durch ein Membrangerät ersetzt werden.

An diesem Punkt des Prozesses liegen die verbleibenden Verunreinigungen normalerweise im µg-Bereich vor; Dies ermöglicht die Verwendung eines starren Harzes in einer Säule mit kurzer Betthöhe (8 bis 12 cm), die mit hoher linearer Geschwindigkeit (450 bis 600 cm/h) betrieben werden kann. Eine Alternative könnten Sartobind Q- oder Emphaze AEX-Membrangeräte sein. Der Hauptvorteil des Emphaze AEX ist seine Virenentfernungskapazität (4 bis 7 LRV), die die LRV-Kapazität des Harzes (3 bis 5 LRV) übertrifft.

Die Hauptakteure hier sind Millipore ViResolve und Asahi-Kasei Planova 20N und BioEX. Der Millipore-Filter ist ein Plate-and-Frame-Filter, während der Asahi-Kasei ein Hohlfasermodul ist. Die Wahl hängt vom endgültigen Maßstab für die Herstellung ab. Bleibt der Herstellungsprozess unter 5.000 l, bevorzugen wir den Asahi-Kasei BioEX oder Planova 20N, da kein Vorfilter erforderlich ist und das Gerät einfacher zu handhaben ist, da es in sich geschlossen ist (kein Halter erforderlich). Bei größeren Produktionsmengen ist der Millipore ViResolve möglicherweise besser geeignet, auch wenn ein Halter und ein Vorfilter erforderlich sind.

Bei der herkömmlichen TFF werden Filter in einem Prozess verwendet und dann zwischen den Einsätzen mit einem Clean-in-Place-Vorgang (CIP) gereinigt. Dies erfordert erhebliche Investitionen in Systemkapazität, Rohstoffe, Energie und Zeit. Hier gibt es drei Hauptakteure: Millipore, Pall und Repligen. Sowohl Millipore als auch Pall stellen Mehrzweckmembranen her, die Reinigungs- und Lagerungsvalidierungsschritte erfordern. Das einzige Einweggerät zur einmaligen Verwendung ist die Repligen TangenX-Linie. Die TangenX SIUS Einweg-TFF-Kassetten von Repligen verhalten sich wie wiederverwendbare Kassetten und bieten Einwegkomfort zu einem Bruchteil der Kosten. Hierbei handelt es sich um eine praktische Alternative, die gebrauchsfertig mit einer Reihe von Porengrößen und Flusskanalkonfigurationen geliefert wird, die für den GMP-Einsatz validiert sind. Sie werden vordesinfiziert und mit 0,2 M NaOH verpackt geliefert. Diese Kassetten sind mit Haltern von Millipore, Pall und Sartorius kompatibel; Neuere Modelle werden in Einweghaltern geliefert.

Ein alternativer Ansatz ist Cadence Single-Pass TFF (SPTFF) von Pall, eine patentierte bahnbrechende Technologie, die eine direkte Durchflusskonzentration ohne Rückführung des Produkts ermöglicht. SPTFF ermöglicht eine hohe Konzentration an scherempfindlichen Proteinen und Antikörpern >160 Gramm/Liter. Möglich wird dies durch ein einzigartiges Flusswegdesign und die Anordnung der Kassetten in Reihe. Die Volumenkapazitäten reichen von mehreren Litern bis zu Tausenden von Litern. Der Cadence SPTFF-Prozess ist kontinuierlich, erzeugt Faktoren mit hoher Konzentration und macht den herkömmlichen Rezirkulationskreislauf überflüssig, wodurch Aggregationsprobleme minimiert werden, kein Mischen erforderlich ist, die Scherbelastung minimiert wird und die Kopplung des SPTFF-Schritts mit anderen nachgelagerten Prozessschritten möglich ist. Zu den weiteren Vorteilen von SPTFF gegenüber herkömmlichem TFF gehören geringere System-Totalvolumina, höhere Rückgewinnungen und geringere Anforderungen an das Spülvolumen. Allerdings müssen die Betriebsbedingungen und die Modulkonfiguration für jeden Single-Pass-TFF-Prozess durch empirische Tests ermittelt werden.

Da die Ernte proteolytische Enzyme und Zelltrümmer enthält, müssen diese so früh wie möglich entfernt werden. Wichtig ist, dass Sie den Prozess mit Ihrer besten Chance beginnen, nicht nur Ihr Zielmolekül einzufangen, sondern auch so viele Verunreinigungen wie möglich zu entfernen.

An dieser Stelle sollten wir über Säulen, Harze und Membranen sprechen. Tarpon Biosystems hat die originalen vorgepackten Einweg-Axialsäulen für den Einsatz bei Xcellerex entwickelt. Diese Technologie wurde anschließend an Repligen und Life Technologies verkauft. Repligen hat die Säulen neu gestaltet und bietet nun vorgepackte Opus-Einwegsäulen von 50 µL bis 150 L (80 cm Durchmesser) an. Sie können mit benutzerdefiniertem Harz (über 300 Harze verfügbar) mit einer Reihe von Betthöhen von 0,25 bis 30 cm gefüllt werden. Sepragen Radial Flow-Säulen (Superflo) arbeiten vier- bis zehnmal schneller bei niedrigerem Betriebsdruck und geringeren Poolvolumina als herkömmliche Axialsäulen und sind in vorgepackten Formaten erhältlich.

Starre Harze lassen sich leichter verpacken, erfordern viel weniger Waschen und bewahren die Bettintegrität ohne Wandunterstützung. Diese Harze können auch bei hohen linearen Geschwindigkeiten (800 bis 1.200 cm/h) ohne nennenswerten Produktivitätsverlust betrieben werden. Pall Danaher vermarktet eine faserbasierte Chromatographieplattform, die durch die Übernahme von Puridify von Cytiva erworben wurde. Dieses Faserformat verfügt über eine offene Porenstruktur, die einen konvektiven Massentransport ermöglicht, was zu von der Durchflussrate unabhängigen Bindungskapazitäten und Zykluszeiten von Minuten im Vergleich zu Stunden bei der herkömmlichen Harzchromatographie führt. Diese Membranen und Fasern können vor der Entsorgung für einen schnellen Kreislauf über eine einzelne Charge hinweg verwendet werden.

Der Einfangschritt durch Affinitätsharz ist die beste Option für mAbs. Affinität ermöglicht eine stärkere Reduzierung von HCP und hcDNA im Durchfluss. Die Wahl der Matrixzusammensetzung trägt auch zur Entfernung oder Zurückhaltung von Verunreinigungen bei und kann die Notwendigkeit einer weiteren Reinigung nach jedem Schritt entweder beseitigen oder erhöhen.

Die Reihenfolge nach dem Einfangschritt wird im Allgemeinen durch die Elutionsbedingungen des vorherigen Schritts bestimmt. Dies reduziert die Manipulation von Puffern zwischen Schritten und vermeidet unnötige TFF-Schritte. Einige Pufferverdünnungen können erforderlich sein, um die Leitfähigkeit oder den pH-Wert des vorherigen Elutionsschritts zu ändern, und sollten nach Möglichkeit in Mischtanks gehandhabt werden, insbesondere bei Bindungs-Elutionsschritten. Durchflussschritte sind normalerweise dem letzten Schritt vor der TFF vorbehalten, da sie dazu neigen, das Volumen der Arzneimittelsubstanz zu erhöhen. Die Verwendung von Membranen anstelle von Harzen in Durchflussschritten trägt dazu bei, die resultierende Volumenzunahme zu reduzieren und den TFF-Konzentrationsschritt zu verkürzen.

Die Wahl des geeigneten Molekulargewichts-Grenzwerts für die TFF-Membran ist von entscheidender Bedeutung. Für mAbs (150 bis 180 kD) beträgt sie normalerweise 100 kD, obwohl es Fälle gibt, in denen kleinere mAbs (<120 kD) anzutreffen sind, die einen engeren Grenzwert (50 bis 70 kD) erfordern. Membranen von 10 bis 30 kD haben einfach keine Porengrößen, die groß genug sind, um die meisten HCPs (<60 kD) und leichten Ketten (25 bis 50 kD) passieren zu lassen.

Schließlich sind die Kosten der wichtigste Faktor bei jeder Reinigungsstrategie. Berücksichtigen Sie beim Entwurf Ihrer Methode stets die Herstellungskosten. Relativ geringe Kostensteigerungen während der PD können bei kluger Wahl zu großen Einsparungen bei der Herstellung führen. Berücksichtigen Sie bei der Auswahl eines bestimmten Schritts (Harz oder Membran) immer die GMP-Herstellungskosten (Validierung, Suite-Zeit, Pufferverbrauch usw.). Lassen Sie stets Ihre kritischen Qualitätsmerkmale die Prozessentwicklung vorantreiben. Wenn Sie gleich zu Beginn den einfacheren oder kostengünstigsten Weg wählen, werden Sie später meist wieder heimgesucht.

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Über den Autor

Jack Vicalvi ist leitender Wissenschaftler und Leiter der Downstream-Prozessentwicklung bei J2 Biopharm Associates, einem Beratungsunternehmen, wo er biopharmazeutische Unternehmen zu GMP-Herstellungsprozessen berät und Unterstützung bei Zulassungsanträgen bietet. Zuvor arbeitete er für Pall Life Sciences als leitender Wissenschaftler und Manager für nachgelagerte Prozessentwicklung. Zuvor hatte er unter anderem Führungs- und Forschungspositionen bei Goodwin Biotechnology, Xcellerex, Exact Labs, Catalent und Sunovion Pharmaceuticals inne. Sein Grundstudium absolvierte er am St. Anselm College, gefolgt von Graduiertenprogrammen in Immunologie an der Southern Illinois University und Parasitologie an der Vanderbilt. Vernetzen Sie sich mit ihm auf LinkedIn.

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