Nachweis viraler RNAs bei Umgebungstemperatur über Reporterproteine, die durch das Ziel produziert werden

Nature Biomedical Engineering (2023)Diesen Artikel zitieren

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Nukleinsäuretests sind in der Regel nicht in Point-of-Care-Umgebungen einsetzbar, da sie kostspielige und hochentwickelte Geräte zur Kontrolle der Reaktionstemperatur und zur Signalerkennung erfordern. Hier berichten wir über einen instrumentenlosen Assay für den genauen und multiplexen Nachweis von Nukleinsäuren bei Umgebungstemperatur. Der Assay, den wir INSPECTR (für interne Splint-Pairing-Expression-Cassette-Translation-Reaktion) genannt haben, nutzt die zielspezifische Splint-Ligation von DNA-Sonden, um Expressionskassetten zu generieren, die flexibel für die zellfreie Synthese von Reporterproteinen gestaltet werden können enzymatische Reporter, die einen linearen Nachweisbereich über vier Größenordnungen ermöglichen, und Peptidreporter (die auf einzigartige Ziele abgebildet werden können), die einen hochgradig multiplexierten visuellen Nachweis ermöglichen. Wir haben INSPECTR verwendet, um eine Reihe von fünf respiratorischen Viruszielen in einer einzigen Reaktion über eine Lateral-Flow-Auslesung und etwa 4.000 Kopien viraler RNA über eine zusätzliche Rolling-Circle-Amplifikation der Expressionskassette bei Umgebungstemperatur nachzuweisen. Die Nutzung der synthetischen Biologie zur Vereinfachung der Arbeitsabläufe in der Nukleinsäurediagnostik kann deren breitere Anwendbarkeit am Point-of-Care erleichtern.

Die anhaltende COVID-19-Pandemie unterstreicht den dringenden Bedarf an neuen und innovativen Diagnosetechnologien, um eine kostengünstige Erkennung von Krankheitserregern am Point-of-Care und am Ort des Bedarfs zu ermöglichen1. Antigen-Schnelltests dominieren weltweit On-Demand-Tests aufgrund ihrer einfachen Handhabung, geringen Kosten und Lagerung bei Raumtemperatur2. Die Identifizierung antigenspezifischer Antikörper, die für die Herstellung solcher Tests erforderlich sind, ist jedoch anspruchsvoll und zeitintensiv und schränkt die Fähigkeit von Antigentests ein, Krankheitserregerstämme und -varianten zu multiplexen oder zu unterscheiden. Molekulare Tests, die virale oder bakterielle Nukleinsäuren nachweisen, sind Antigen-Schnelltests vorzuziehen, da sie schnellere Entwicklungszyklen, eine bessere Unterscheidung von Varianten, höhere Empfindlichkeiten und bessere Nachweisgrenzen (LoD)3 aufweisen. Dennoch erfordert der Goldstandard für solche Tests, die quantitative Polymerasekettenreaktion (qPCR), hochentwickelte Instrumente zur Kontrolle des Temperaturzyklus und zum Nachweis der Amplifikation spezifischer Zielsequenzen und ist schwierig am Ort des Bedarfs einzusetzen4. Eine instrumentenfreie Analyse- und Nachweismethode könnte den Zugang zu sensiblen molekularen Tests für Verbraucher erheblich verbessern, insbesondere für diejenigen, die keinen Zugang zu zentralen Testlabors haben5.

Die präzisen zyklischen Erwärmungsanforderungen der qPCR wurden durch isotherme Nukleinsäureamplifikationsstrategien wie die schleifenvermittelte Amplifikation (LAMP)6, die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA)7,8 und die Nicking-Enzym-Amplifikationsreaktion (NEAR)9 berücksichtigt. Viele dieser Strategien koppeln die Amplifikation mit einem Nachweisschritt, bei dem fluoreszierende Sonden (wie RPA) oder Molecular Beacons (wie NEAR) eingesetzt werden, um eine zusätzliche Ebene der Spezifität bereitzustellen. Andere Methoden wie SHERLOCK oder DETECTR nutzen die CRISPR-Technologie, um die Amplifikation über die Freisetzung eines gequenchten Fluorophors mithilfe der Begleitaktivität der programmierbaren Nukleasen Cas12 oder Cas13 nachzuweisen (Ref. 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16). 17). Diese isothermen Strategien erfordern jedoch immer noch Instrumente: tragbare Heizgeräte, um die optimale Temperatur für die Enzymaktivität während der exponentiellen Amplifikation zu erreichen und aufrechtzuerhalten, und Photometer zur Messung der Fluoreszenz. Darüber hinaus verfügen solche isothermen Amplifikationstechniken aufgrund von Herausforderungen beim Primerdesign und der Überlappung der Emissionsspektren fluoreszierender Reporter nur über eine begrenzte Multiplexfähigkeit.

Im Gegensatz dazu ermöglichen Strategien der synthetischen Biologie den Nachweis von Nukleinsäuren mit flexibleren proteinbasierten Auslesungen. Die Genexpression kann mithilfe eines sequenzspezifischen Riboregulators, beispielsweise eines Halteschalters, gesteuert werden, sodass nur die Ziel-RNA-Sequenz (oder „Auslöser-RNA“) ein Signal weiterleitet, um die Produktion eines Proteinreporters zu aktivieren18. Da diese Reporter fluoreszierend, kolorimetrisch oder lumineszierend sein können, sind verschiedene Detektionsmodi möglich. Insbesondere Zehenschalter wurden für die In-vitro-Molekulardiagnostik in ressourcenarmen Umgebungen eingesetzt19. Die von Krankheitserregern abgeleiteten Zielsequenzen werden direkt einer gefriergetrockneten zellfreien Expressionsreaktion (CFE)20 hinzugefügt, oft nach Voramplifikation, was einen lagerstabilen und empfindlichen Nachweis von Ebola20, Zika21, Norovirus22, C. difficile23, HIV24 und SARS ermöglicht -CoV-2 (Lit. 25) Sequenzen. Obwohl diese zellfreien Expressionsreaktionen unter Umgebungsbedingungen durchgeführt werden können, bedeutet die erforderliche Voramplifikation oft, dass immer noch Ausrüstung erforderlich ist.

Hier berichten wir über INSPECTR, eine modulare Umgebungstemperaturstrategie für den empfindlichen, spezifischen, multiplexierbaren und quantitativen Nukleinsäurenachweis. Ähnlich wie bei Strategien für die transkriptomische Profilierung (wie cRASL-seq26, TempO-Seq27 oder SplintQuant28) oder der Aptamer-basierten Diagnostik (wie SENSR29 oder SNAILS30) wird RNA durch die Splint-Ligation entworfener DNA-Sonden nachgewiesen. Bei INSPECTR erzeugt die Ligation jedoch direkt eine Expressionskassette, die für die zellfreie Synthese eines Reporterproteins programmiert ist. Diese Strategie ermöglicht es, die Translation eines beliebigen Polypeptids durch das Vorhandensein einer spezifischen, nicht verwandten Nukleinsäuresequenz auszulösen, was wiederum hochmultiplexierte Assays unter Verwendung einer Lateral-Flow-Auslesung ermöglicht. INSPECTR vermeidet eine Verstärkung des Ziels; Stattdessen wird der Nachweis durch zellfreie Expression von Enzymen oder Peptiden und, falls gewünscht, durch Amplifikation der ligierten Sonde bei Umgebungstemperatur erreicht. Wir implementieren unseren Arbeitsablauf im Kontext des Nachweises viraler genomischer RNA und demonstrieren sowohl den empfindlichen (Nachweisgrenze von ca. 4.000 Kopien) als auch den spezifischen multiplexierbaren Nachweis einer Reihe (N = 5) respiratorischer viraler Zielsequenzen, alles bei Umgebungstemperatur. Wir gehen davon aus, dass die Modularität und Vielseitigkeit der INSPECTR-Plattform ein wichtiges Werkzeug zum Arsenal der auf synthetischer Biologie basierenden Strategien für die Molekulardiagnostik darstellen und weitere Innovationen und den Einsatz zellfreier Expressionssysteme zur Gewährleistung der globalen Gesundheit vorantreiben wird.

Ein Überblick über den INSPECTR-Arbeitsablauf ist in Abb. 1 dargestellt. Im ersten Schritt hybridisieren einzelsträngige DNA-Sonden (ssDNA) mit einem RNA-Ziel, das als Schiene für die Ligation durch die Chlorella-Virus-DNA-Ligase (SplintR) fungiert, ähnlich dem Vorhängeschloss-Sonden-Methode für den microRNA-Nachweis31. Als nächstes synthetisiert eine DNA-Polymerase den komplementären Strang der ligierten ssDNA-Sonde, um eine doppelsträngige DNA-Expressionskassette (dsDNA) zu erzeugen. Diese Expressionskassette kodiert ein Reporterprotein unter der Kontrolle der Transkription durch T7-RNA-Polymerase. Bei Zugabe zu einem zellfreien Expressionssystem, das Ribosomen, T7-RNA-Polymerase, Translationsfaktoren, Aminosäuren, Nukleotide und zusätzliche Cofaktoren32,33,34 enthält, ergibt die Expressionskassette ein Reporterprotein, das visuell oder elektronisch nachgewiesen werden kann. Der gesamte INSPECTR-Arbeitsablauf erfolgt bei Umgebungstemperatur und erfordert keine Voramplifikation der Nukleinsäure. Darüber hinaus entkoppelt diese Designstrategie die Eingabesequenz von der Expressionsausgabe und schafft so die Flexibilität, jede Zielnukleinsäure mit einer breiten Palette von Reporterproteinen zu koppeln.

Einzelsträngige DNA-Sonden, die Homologie zu einer bestimmten Ziel-RNA aufweisen sollen, werden nur dann ligiert, wenn die RNA eine ternäre Molekülverbindung trennt. Die ligierten Sonden dienen als Matrize für die Doppelstrangbildung durch eine DNA-Polymerase. Das lineare doppelsträngige Produkt kodiert eine vollständige Reporter-Expressionskassette, einschließlich eines T7-Promotors, einer Ribosomenbindungsstelle (RBS), eines Reporterproteins und eines T7-Terminators. Wenn sie einem zellfreien Expressionssystem hinzugefügt werden, erzeugen Transkription und Übersetzung eine modulare Reporterausgabe, die elektronisch oder visuell gemessen werden kann.

Wir begannen unseren Designprozess mit der Bewertung leicht nachweisbarer Reporterprotein-Outputs für die nachgeschaltete zellfreie Expressionsreaktion (CFE). Herkömmlicherweise basieren die zellfreie Expression und verwandte Biosensoren auf hohen Konzentrationen von DNA-Matrizen (10 nM oder höher), die auf Transkriptions- oder Translationsebene reguliert werden35. Mithilfe des INSPECTR-Mechanismus „aktiviert“ jede Zielnukleinsäure nur ein Paar ssDNA-Sonden, um eine einzelne dsDNA-Expressionskassette zu bilden. Wir gingen daher davon aus, dass INSPECTR aus einer sehr kleinen Anzahl von Expressionskassetten einen nachweisbaren Reporter generieren müsste. Im Gegensatz zu früheren Bemühungen zur CFE-Optimierung, bei denen die Konzentration der DNA-Matrize kein limitierender Faktor ist, haben wir versucht, das Reportersignal pro Expressionskassette zu optimieren. Wir haben lineare dsDNA-Expressionskassetten für drei mutmaßliche Reporterproteinausgänge entwickelt: Beta-Galactosidase (LacZ), die visuell nachgewiesen werden kann und in zellfreien Biosensoren 22,36 häufig verwendet wird; ein 3x-FLAG- und Twin-Strep-tag-haltiges Peptid, das mit einem Lateral-Flow-Assay nachgewiesen werden kann; und Nanoluciferase (nLuc), die eine lichtemittierende Reaktion katalysiert, die auf einem Plattenlesegerät nachweisbar ist. Anschließend haben wir die mögliche Nachweisgrenze für jeden Reporter geschätzt.

Indem wir das kleine 45 Aminosäuren lange Alpha-Fragment von LacZ exprimierten und das gereinigte Omega-Fragment-Komplement hinzufügten, konnten wir eine Farbänderung feststellen, wenn eine DNA-Expressionskassette in Konzentrationen von etwa 1 pM zugeführt wurde (Abb. 2a). Da INSPECTR die Zielsequenz jedoch nicht amplifiziert, würde dieser Empfindlichkeitsgrad mindestens 60 Millionen Zielkopien pro Reaktion erfordern, was außerhalb des Bereichs der klinischen Relevanz liegt.

a–c, Nach physiochemischer Optimierung konnten Schein-„vorligierte“ dsDNA-Expressionskassetten bis zu (a) ~1 pM (kolorimetrischer Reporter, bei dem eine einfache visuelle Erkennung für eine Absorption ≥1,0 angenommen wurde), (b) ~1 fM nachgewiesen werden (Peptid-Reporter, Lateral-Flow-Assay) und (c) ~ 1 aM oder 10 Expressionskassetten (Lumineszenz-Reporter, Plattenlesegerät) nach 2 Stunden Expression bei 22 °C sowohl in einem gereinigten System (PURExpress In-vitro-Proteinsynthese-Kit) als auch rohes E. coli-Lysat. Experimentelle Details finden Sie unter Methoden. Die aufgezeichneten Daten stellen technische Replikate und deren Mittelwert bei der angegebenen Konzentration der Expressionskassette (EC) dar. Das entsprechende Signal bzw. die Zeit bis zum Ergebnis für die No-Template-Kontrolle (NTC) ist mit einer horizontalen gepunkteten Linie dargestellt.

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Die Peptid- und nLuc-Reporter-Ausgaben waren weitaus empfindlicher. Unter Verwendung einer im Handel erhältlichen rekonstituierten Transkriptions-Translations-Reaktion mit gereinigten Enzymen (PURExpress37) und eines selbst erzeugten Extrakts38 konnten wir nur 1 fM der linearen dsDNA-Expressionskassette, die ein Reporterpeptid kodiert, und etwa 1 aM der Kassette, die nLuc kodiert, nachweisen (<10 Expressionskassetten pro Reaktion) (Abb. 2b, c). Beim Vergleich der linearen Dosis-Wirkungs-Kurven von dsDNA-Templat und gereinigtem nLuc schätzen wir, dass Transkription und Translation eine Verstärkung um den Faktor 105–106 bewirken. In Übereinstimmung mit früheren Modellen skaliert die Proteinausbeute bei niedrigen Template-Konzentrationen (<1 pM) linear mit der bereitgestellten Template-Menge39. Da jedes Reporterprotein als Ergebnis der INSPECTR-Reaktion unterschiedliche Eigenschaften hätte, haben wir die Enzyme und Peptide separat bewertet.

Der hochempfindliche und lineare Nachweis von schein-vorligierter dsDNA in Abb. 2c deutete darauf hin, dass nLuc aufgrund seiner geringen Größe und hohen Leuchtkraft eine nützliche Reporterausgabe für INSPECTR sein könnte40. Wir haben daher Lumineszenzsonden zum Nachweis des SARS-CoV-2-RNA-Genoms entwickelt. Da die Hybridisierungssequenz in einer INSPECTR-Sonde zwangsläufig in der endgültigen Expressionskassette vorhanden ist (Abb. 1), haben wir zunächst nach permissiven Insertionsstellen in der kodierenden Sequenz (CDS) von nLuc gesucht, die keinen Einfluss auf die Expression oder Funktion der übersetzten Sequenz haben würden Enzym. Wir haben vier 30-nt-DNA-Sequenzen, die zu konservierten Regionen von Interesse (ROIs) im SARS-CoV-2-Genom komplementär sind, in unterschiedlichen strukturellen Kontexten im CDS des 171-aa-nLuc-Proteins angeordnet. Bei der Gestaltung der Zielregionen zielten wir darauf ab, die Konservierung in viralen Genomen über jegliche Sequenzpräferenzen hinaus zu maximieren, wobei wir frühere Studien zur Kenntnis nahmen, die darauf hindeuteten, dass SplintR RNA gut ligiert, solange die Überhänge länger als 4–6 nt sind (Ref. 41, 42). Wir hielten die Verbindung ungefähr symmetrisch und versuchten sicherzustellen, dass das 5′-Phosphatdonornukleotid kein dG oder dC war, entsprechend der Sequenzpräferenz des Enzyms. Bei Expression mit geringer Kopiezahl (2 fM der Expressionskassette) in CFE-Reaktionen stellten wir fest, dass etwa die Hälfte dieser Insertionen im Vergleich zum Wildtyp entweder die Proteinsynthese oder die Proteinfunktion aufhob (WT, Abb. 3a). Für eine Untergruppe der Insertionsvarianten, die keinen Einfluss auf die Funktion hatten, konstruierten und testeten wir geteilte ssDNA-Sonden zum Nachweis der Ziel-RNA-Sequenzen und identifizierten einen Sondensatz (gespalten nach dem elften Rest in nLuc) mit hohem Signal nur in Gegenwart von Ziel.

a, Design von Sonden. Vier konservierte 30-nt-Sequenzen aus dem SARS-CoV-2-Genom (S1–S4) wurden in acht Stellen des CDS von nLuc im oberen Strang der dsDNA-Expressionskassette eingefügt. Diese 32 simulierten „vorligierten“ dsDNAs wurden durch CFE bei einer Konzentration von 2 fM exprimiert, um funktionelle Proteinvarianten zu identifizieren. Die verwendeten Peptidinsertionssequenzen waren wie folgt: S1, SETKSLRSES; S2, AQSPIKVESA; S3, TIKVLINNFN; S4, LVSINTATIV. Die gemeldeten Daten sind auf die Lumineszenz der unmodifizierten nLuc-Kassette normiert; Ein Signal über 100 weist auf ein Protein hin, das besser funktioniert als der Wildtyp, mit N = 2 technischen Replikaten. Fehlerbalken geben die Standardabweichung des Mittelwerts an. b, Lumineszenz-INSPECTR-Assay. Der Sondensatz, der der Insertionssequenz S2 an den Resten 11/12 entspricht, wurde in einer SplintR-Ligase-Reaktion bei 22 °C entweder an eine synthetische oder eine genomische SARS-CoV-2-RNA-Sequenz ligiert. Nach 30 Minuten wurde die Reaktion 1:2 in eine PURExpress CFE-Reaktion verdünnt und die Lumineszenz wurde 20 Minuten lang kontinuierlich überwacht. Die aufgezeichneten Daten stellen das Endpunkt-Lumineszenzsignal von drei unabhängigen biologischen Replikaten aus separaten Ligationen dar. (Einzelne Replikate werden geplottet, sind aber aufgrund der Markergröße nicht sichtbar.) R2 wurde nach Log-Log-Transformation der Daten in GraphPad Prism (v9.4.0) berechnet.

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Als nächstes testeten wir die Funktion dieser Sonde in einem zweistufigen, 50-minütigen Arbeitsablauf, bei dem die ligierte Sonde während der Expressionsreaktion doppelsträngig war (Abb. 3b). In diesem Umgebungstemperaturtest detektierte die nLuc-Sonde 1 fM kurze synthetische Ziel-RNA und 10 fM extrahierte SARS-CoV-2-RNA, was etwa 1.000 Genomkopien in der Ligationsreaktion entspricht. Nach wie vor war die Reaktion über einen Konzentrationsbereich von vier Größenordnungen hochgradig linear. Da es in diesem Arbeitsablauf keine exponentielle Amplifikation des Ziels gibt, kann das RNA-Ziel effektiv direkt anhand einer linearen Kalibrierungskurve quantifiziert werden. Wir messen einen etwa 1.000-fachen Empfindlichkeitsverlust durch den Ligations-Expressions-Workflow im Vergleich zu den „schein-vorligierten“ dsDNA-Experimenten in Abb. 2c. Frühere Berichte deuten darauf hin, dass die SplintR-Ligation nie vollständig abläuft, selbst bei hohen Temperaturen und hohen Enzymkonzentrationen im Verhältnis zu den DNA-Substraten43. Dies führt zu einem Empfindlichkeitsverlust, der durch Ineffizienzen bei der Matrizendoppelsträngung, eine Vergiftung der Expressionsreaktion durch den Ligationspuffer und eine Verdünnung zwischen den Reaktionsschritten verstärkt wird. Weitere Optimierungen der ssDNA-Sondenarchitektur oder des Ligase-Engineerings werden wahrscheinlich notwendig sein, um die Empfindlichkeit dieses Zweitopf-Assays weiter zu verbessern.

Während ein Lumineszenzreporter den quantitativen RNA-Nachweis bei Umgebungstemperatur ermöglichte, wollten wir INSPECTR zu einem wirklich instrumentenfreien Assay entwickeln, der die Benutzerfreundlichkeit von Antigen-Schnelltests nutzt. Um zunächst den typischen Prozessumgestaltungszyklus für ein Ziel zu verkürzen und die „Trefferquote“ der in Abb. 3a beschriebenen Funktionssonden zu verbessern, haben wir eine Reportererkennungsstrategie entwickelt, die für jede RNA-Zieleingabe universell ist. Wir haben eine Sandwich-Immunoassay-Strategie gewählt, um die durch zwei Analytbindungsereignisse ermöglichte Spezifität zu nutzen. Wir stellten die Hypothese auf, dass die beiden Bindungsereignisse die Hintergrunderkennung von Störausgängen verringern würden, die durch die Expression einer teilweise gebildeten Expressionskassette verursacht werden. Anschließend suchten wir nach Epitopen, die den Peptidreporter an den N- und C-Termini flankieren und durch einen universellen Lateral-Flow-Immunoassay nachgewiesen werden könnten. Um hochaffine Antikörper- und Epitoppaare auszuwählen, die eine Lateral-Flow-Detektion ermöglichen, erstellten wir Screening-Bibliotheken von Peptiden, die von Epitopkandidaten flankiert wurden, wobei jede Bibliothek aus 20 (Lit. 12) möglichen Peptid-Reporterstrukturen entnommen wurde. Die Peptidbibliothek wurde durch zellfreie Expression synthetisiert, um die Struktur der INSPECTR-Proteinausgänge zu bewahren und alle Antikörperkandidaten zu eliminieren, die mit CFES-Komponenten kreuzreagieren. Monoklonale Antikörper wurden in einem Lateral-Flow-Immunoassay-Format gegen die Epitopkandidaten gescreent, und zwar sowohl als Einfang- (auf Nitrozellulosemembran gestreift) als auch als Detektionsantikörper (aktiv an Goldnanopartikel konjugiert) (Abb. 4a, links).

Expressionskassetten kodieren Reporterpeptide mit internen Sequenzen von 36 Basenpaaren, flankiert von unterschiedlichen N- und C-terminalen Epitopen, die den Nachweis durch einen Sandwich-Lateral-Flow-Immunoassay ermöglichen. Die Intensität der entwickelten Testlinie(n) kann visuell beurteilt oder von ImageJ gescannt und analysiert werden, um den Testmembranhintergrund zu subtrahieren. a, links: Nachweis von 187 einzigartigen Dual-Epitop-Peptiden mit 3x-FLAG- (E1, N-terminal) und Twin-Strep-tag- (E2, C-terminal) Epitopen durch universellen Lateral-Flow-Immunoassay. Die interne Sequenz jedes Peptids stellt eine 12-Aminosäuresequenz dar, die aus 36-Basenpaar-Sequenzen übersetzt wurde, die aus dem SARS-CoV-2-Genom stammen. Rechts: Datenpunkte stellen die vom Hintergrund abgezogene Testlinienintensität des Nachweises von 187 Peptiden mit technischen Replikaten dar. b, links: Spezifischer Nachweis von 7 einzigartigen Dual-Epitop-Peptiden mit einzigartigem N-terminalem Epitop, interner SARS-CoV-2-Sequenz und Twin-Strep-tag-Epitop (E2, C-terminal) durch Lateral-Flow-Immunoassay. Die Expressionskassette jedes Peptids, das dem zellfreien Expressionssystem hinzugefügt wird, erzeugt ein Dual-Epitop-Peptid, das spezifisch von räumlich gemultiplexten Testlinien-Antikörpern eingefangen wird. Oben rechts: gescannte Bilder repräsentativer Teststreifen. Unten rechts: aufgetragene Daten, die die vom Hintergrund abgezogene Testlinienintensität von zwei technischen Replikaten unabhängiger biologischer Triplikate und deren Mittelwert darstellen.

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Funktionelle Antikörper- und Epitoppaare wurden für die weitere Lateral-Flow-Entwicklung und -Optimierung zur Verbesserung der Empfindlichkeit ausgewählt. Wir haben die Expression von Epitopkandidaten sowohl in PURExpress als auch in einem Rohextrakt (NEBExpress) validiert, sind aber letztendlich auf NEBExpress umgestiegen, damit wir das His-Epitop in unsere Reporterbibliothek aufnehmen konnten; Die Enzyme von PURExpress sind zur Reinigung mit einem His-Tag versehen und übertreffen das Einfangen von Dual-Epitop-Peptiden mithilfe eines His-Tags. In Übereinstimmung mit zuvor berichteten Verwendungen von Epitop-Tags stellten wir fest, dass einige Epitope entweder am N- oder C-Terminus des Reporters besser funktionierten, wahrscheinlich aufgrund einer verbesserten zellfreien Translation. Wir fanden auch heraus, dass der Einschluss der 12-Aminosäuren-Translation der RNA-Zielsequenz, die als Linker zwischen den beiden Epitopen des Peptidreporters dient, das Risiko einer sterischen Behinderung des Antikörpers verringerte. Darüber hinaus haben wir durch die Verwendung multimerer Epitope die Nachweisempfindlichkeit um das Hundertfache verbessert (z. B. 3x-FLAG und Twin-Strep-tag) (ergänzende Abbildung 2 (monomerer vs. multimerer Nachweis)). Durch unsere Auswahlstrategie haben wir Antikörper identifiziert, die trotz Variationen in den internen Sequenzen Dual-Epitop-Peptid-Reporter robust einfangen und nachweisen können. Um den universellen Nachweis eines Dual-Epitop-Reporters mit 3x-FLAG (N-Terminus) und Twin-Strep-Tag (C-Terminus) zu validieren, haben wir 187 Expressionskassetten entworfen, die jeweils für einen 3x-FLAG- und Twin-Strep-Tag-Reporter kodieren aber mit einzigartigen, 36 Basenpaaren langen internen Sequenzen, die ROIs darstellen, die das SARS-CoV-2-Genom kacheln. Nach einer zweistündigen Expressionsreaktion bei Umgebungstemperatur wurde die Ausgabe jeder Expressionskassette mit einem Laufpuffer gemischt und Nanopartikel an Anti-Strep-Tag-II-Antikörper konjugiert. Der Dual-Epitop-Peptid-Reporter durchlief dann einen Lateral-Flow-Halbstreifentest mit einer Anti-FLAG-Antikörper-Testlinie. Alle 187 Peptidreporter, die aus 10 pM Expressionskassette generiert wurden, entwickelten eine visuell erkennbare Linie auf dem universellen Lateral-Flow-Streifen (Abb. 4a, rechts), was auf die zielunabhängige Universalität des Dual-Epitop-Reporter-Ansatzes hinweist.

Angesichts der inhärenten Fähigkeit zellfreier Systeme, mehrere Ausgaben gleichzeitig auszudrücken44,45, ermöglicht INSPECTR Multiplexing, indem jede Reporterausgabe einer eindeutigen RNA-Eingabe zugeordnet wird. Zunächst versuchten wir, gleichzeitig exprimierte Peptidreporter auf einem einzelnen Lateral-Flow-Streifen aufzulösen. Um das Risiko von Off-Target-Signalen während des Multiplexens zu minimieren, wurden zuvor gescreente Antikörper auf geringe Kreuzreaktivität validiert. Anschließend wurden Antikörper, die die epitopspezifische Aktivität im Lateral-Flow-Format beibehielten, für die Entwicklung zu einem räumlich gemultiplexten Teststreifen ausgewählt (Abb. 4b). Um die Variabilität der Affinität der Antikörper zu ihren jeweiligen Epitopen zu berücksichtigen, haben wir die Streifenreihenfolge und Pufferzusammensetzung der Antikörper empirisch optimiert. Antikörper, die in einem 1-Plex-Format die höchste Empfindlichkeit aufwiesen, wurden im Allgemeinen näher an der Kontrolllinie gestreift, um das für schwächer bindende Antikörper verfügbare Detektionskonjugat zu maximieren. Das Resuspendieren von Testlinien-Antikörpern in einem zuckerhaltigen Striping-Puffer verbesserte auch die Benetzbarkeit an den Testlinien und reduzierte unspezifische Bindung. Um Reportern die Spezifität der optimierten Teststreifen zu demonstrieren, haben wir sieben Expressionskassetten entworfen, von denen jede ein einzigartiges N-terminales Epitop, aber eine gemeinsame 12-Aminosäuren-interne Sequenz und ein C-terminales Epitop (Twin-Strep-tag) kodiert. Ein einzelnes Detektionsantikörperkonjugat zielte auf den Twin-Strep-tag-Tag jedes Reporterpeptids, das dann spezifisch auf seiner jeweiligen Testlinie eingefangen werden konnte. Wir haben einen Satz von sieben orthogonalen Peptidausgängen generiert, die auf einem einzelnen Streifen erfasst werden konnten (Abb. 4b). Wir stellten fest, dass das Testsignal reduziert wurde, wenn alle Reporter in einer einzigen Reaktion gleichzeitig exprimiert wurden, möglicherweise aufgrund der Konkurrenz um Transkriptions- und Übersetzungsressourcen oder um das Detektionskonjugat. In Zukunft könnte dieser Wettbewerb gemildert werden, indem die Reporter so umgestaltet werden, dass sie über einzigartige C-terminale Epitope verfügen und mehrere Detektionskonjugate verwendet werden.

Um die Nützlichkeit dieses Multiplex-INSPECTR-Assays zu demonstrieren, haben wir INSPECTR-Peptidsonden gescreent, die jeweils auf drei ROIs von fünf Atemwegspathogenen abzielen: die Wuhan- und Delta-Varianten von SARS-CoV-2, das Influenza-A-Virus (IAV), das Influenza-B-Virus (IBV) und die Atemwege Syncytial-Virus (RSV). Für jeden ROI haben wir Sonden entwickelt, die jedes der Reporterpeptide kodieren, die zuvor von den Universal- und Multiplex-Teststreifen erkannt wurden. Um die Möglichkeit einer Selbstverblockung der Sonde zu verringern, die zu einem ligaseabhängigen Hintergrund führen könnte, haben wir in jede Sonde zwei aufeinanderfolgende Ligationsverbindungen eingebaut, die von einem kurzen 10 nt langen lückenfüllenden Oligonukleotid (GFO) überspannt sind (Abb. 5a). Diese Strategie reduziert den Assay-Hintergrund, da die Transkription von nicht ordnungsgemäß ligierten Expressionskassetten eine mRNA mit einer Frameshift-Mutation von –1 im zweiten Epitop erzeugen würde, wodurch ein Peptid entsteht, das im Lateral-Flow-Assay nicht nachgewiesen werden kann. Unter Verwendung einer Modellsonde und quantitativer Auslesung durch PCR und zellfreie Expression stellten wir fest, dass das Hinzufügen dieser zweiten Ligationsverbindung zu einer geringfügigen (~50 %) Verringerung der Ligationseffizienz und des ON-Signals führte, aber zu einem stark reduzierten Sonden-„Leck“ (Ligase- unabhängiger Ausdruck) (Extended Data Abb. 1).

a, Erzeugung von fünf einzigartigen Reporterpeptiden, die durch RNA-Target-gestützte Ligation von DNA-Sonden transduziert werden. Peptide werden spezifisch durch räumlich gemultiplexte Testlinien-Antikörper eingefangen. b, Spezifischer Nachweis von Peptiden, die durch RNA-Zielerkennung transduziert werden. Ein einzelnes RNA-Ziel, das in einen Cocktail aus DNA-Sonden eingeführt wird, ergibt ein Peptid, das spezifisch von einer vorher festgelegten Testlinie eingefangen wird. Die Zugabe aller fünf RNA-Ziele zu einem Cocktail aus DNA-Sonden ermöglicht die Koexpression jedes Peptid-Reporters und die anschließende Erfassung auf vorab festgelegten Testlinien. Oben: gescannte Bilder repräsentativer Teststreifen. Unten: Die aufgezeichneten Daten stellen die vom Hintergrund abgezogene Testlinienintensität von zwei Replikaten unabhängiger biologischer Duplikate und ihren Mittelwert dar.

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Anschließend wurde jede Sonde auf ihre Transduktion einer synthetischen Ziel-RNA in ein Reporterpeptid untersucht, wie auf einem Single-Plex-Teststreifen nachgewiesen. Mit unserem neuen Design erzeugten nur drei der 120 getesteten Sonden in Abwesenheit eines RNA-Ziels ein Hintergrund-Lateral-Flow-Signal. Die Sonden, die Reporter mit OLLAS- oder Myc-Epitopen erzeugten, lieferten aufgrund der geringeren Antikörper-Einfangaffinität der Testlinie ein geringeres Testsignal als andere Reporter und wurden aus weiteren Tests ausgeschlossen. Um das Sonden-Multiplexing zu bewerten, haben wir eine Teilmenge der verbleibenden Sonden zu Kombinationen von jeweils fünf Sondensätzen zusammengefasst, die für jeden Krankheitserreger einen eindeutigen Reporter kodieren würden (Abb. 5a). Die Zugabe jedes einzelnen synthetischen RNA-Ziels zu einem optimierten Pool aller Sonden ergab einen einzigartigen Peptid-Reporter, der spezifisch auf verschiedenen Testlinien eines Multiplex-Teststreifens eingefangen wurde. In ähnlicher Weise erzeugte die Zugabe aller fünf RNA-Ziele zum Pool auch Peptide, die sich zu visuell erkennbaren Testlinien auf dem Teststreifen entwickelten (Abb. 5b). Letztendlich stellten wir fest, dass der Dual-Epitop-Peptidreporter den Fünf-Plexus-Nachweis von RNA-Zielen nach einer gepaarten Ligation bei Umgebungstemperatur und einem zellfreien Expressionstest ermöglichte. Die Modularität dieses Ansatzes könnte eine schnelle Neugestaltung des Assays ermöglichen, um alternative RNA-Ziele zu erkennen, indem nur der Zielbindungsteil der Sonden neu gestaltet wird.

Nachdem wir festgestellt hatten, dass die Produktion eines Dual-Epitop-Peptids eine visuelle Multiplex-Auslesung von INSPECTR ermöglichen kann, versuchten wir als nächstes, die Empfindlichkeit des Assays zu verbessern. Wir glaubten nicht, dass eine weitere Optimierung der Transkriptions- und Übersetzungsschritte zu einer wesentlichen Verbesserung der Empfindlichkeit führen könnte. Es wäre notwendig, die Anzahl der Expressionskassetten zu erhöhen, bevor die zellfreie Expression beginnt. Mehrere isotherme Methoden der Nukleinsäureamplifikation wurden bei oder unter 37 °C demonstriert (Ref. 47,48), darunter einige, die nicht instrumentiert sind und die Körperwärme des Bedieners zur Wärmeregulierung nutzen8 oder bei Raumtemperatur durchgeführt werden49. Wir waren an der Einführung einer Methode interessiert, die bei Umgebungstemperatur (22 °C) ohne Wärmequelle durchgeführt werden kann.

Wir haben uns für die Optimierung einer Amplifikationsmethode auf Basis der Rolling-Circle-Amplifikation (RCA) entschieden, da die primären Enzyme (SplintR-Ligase und Φ29-DNA-Polymerase) bei Temperaturen nahe Umgebungstemperatur aktiv sind und eine Amplifikation bei oder unter 30 °C nachgewiesen wurde50. Dies erforderte eine Neugestaltung und Verbindung der Ligationssonden, sodass die intakte Expressionskassette nach der Ligation zirkulär und nicht linear ist, wie in Abb. 6a dargestellt. Sobald die Ligation abgeschlossen ist, werden Primer und Φ29-Polymerase eingeführt, um die Expressionskassette zu verstärken. Wir haben die Empfindlichkeit des Prozesses entweder mit einem einzelnen Primer (linearer RCA), Paaren zielspezifischer Primer (hyperverzweigter RCA) oder zufälligen Primern gemessen. Wir fanden heraus, dass zufällige 6-mer-Primer, die mit Phosphorothioatbasen modifiziert waren, um den Exonukleaseverdau durch Φ29 zu verhindern, das beste Signal lieferten. Wir fanden auch heraus, dass die Einbeziehung eines Exonukleaseschritts nach der Ligation und vor der RCA für die Reduzierung des Hintergrundsignals unerlässlich war. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Amplifikationsreaktion sehr empfindlich auf die Glycerinkonzentration reagierte, weshalb wir, wo immer möglich, hochkonzentrierte Enzyme oder glycerinfreie Formulierungen verwendeten.

a, Modifikation von Sonden, um zirkuläre Expressionskassetten zu erstellen. Durch die Verbindung der beiden Sonden, die Epitopsequenzen enthalten, ist das Ergebnis eines zielvermittelten Ligationsereignisses eine zirkuläre Expressionskassette. Die Hinzufügung von Φ29 und zufälligen Hexameren ermöglicht die Verstärkung dieses Kreises. Anstatt dass jedes Zielmolekül wie in Abb. 4a zu einer einzelnen Expressionskassette führt, wird jedes Ziel in Tausende von Expressionskassetten umgewandelt, die durch Transkription und Translation im zellfreien Extrakt weiter verstärkt werden. b: Empfindlichkeit des Assays auf einem strukturierten genomischen RNA-Ziel (gRNA). Der RCA-gestützte Assay wurde mit einer Verdünnungsreihe von aus SARS-CoV-2 extrahierter gRNA durchgeführt. Auf einem Lateral-Flow-Streifen konnten bereits 3,5 fM (~4.000 cps) nachgewiesen werden. Die aufgetragenen Datenpunkte repräsentieren die vom Hintergrund abgezogene Testlinienintensität von N = 8 biologischen Replikaten. Fehlerbalken geben die Standardabweichung des Mittelwerts an. ****P < 0,0001 für einen ungepaarten zweiseitigen t-Test mit Welch-Korrektur für ungleiche Varianz (N = 8). c, Nachweis intakter Viruspartikel. Nach der Entwicklung einer schnellen Lysemethode konnte intaktes SARS-CoV-2 mit einer LoD nachgewiesen werden, die der von extrahierter gRNA ähnelt. Die Lyse ist nach 30 s bei Raumtemperatur abgeschlossen. Die aufgezeichneten Datenpunkte stellen vom Hintergrund abgezogene Testlinienintensitäten unabhängiger biologischer Replikate dar.

Quelldaten

Das Produkt der RCA-Reaktion beginnt als langes lineares Molekül, das aus Concatemeren der zirkulären Sequenz besteht, und dies ermöglichte uns die Implementierung einer zusätzlichen Korrekturlesefunktion. Um die Expression von Kreisen zu verhindern, die durch die falsche Ligation der Epitop-kodierenden Sonde mit sich selbst erzeugt wurden, wurde der T7-Promotor auf das GFO verschoben. Dies verringerte die Wahrscheinlichkeit, dass eine Ligation ohne Templat zu einer aktiven Expressionskassette führt, da zwei Ligationsereignisse über zwei verschiedene Moleküle hinweg erforderlich sind, um einen amplifizierbaren Kreis zu erzeugen, der sowohl den T7-Promotor als auch die Epitop-kodierende Sonde enthält (Abb. 6a).

Um die Empfindlichkeit des RCA-verstärkten Assays zu demonstrieren, wurden Verdünnungen der genomischen RNA von SARS-CoV-2 hergestellt und dienten als Matrizen für die Ligation der zirkularisierbaren Sonden. Nach einem 2-stündigen RCA-Schritt und einem 5-minütigen Exonukleaseschritt wurde das amplifizierte Produkt als Substrat für die zellfreie Expression verwendet und die resultierenden Peptide wurden durch Lateral Flow analysiert. Wie in Abb. 6b gezeigt, verbesserte dieser Amplifikationsschritt die LoD des Assays auf 3,5 fM (4.200 Kopien) der Ziel-RNA unter Verwendung eines Arbeitsablaufs bei vollständiger Umgebungstemperatur.

Als abschließende Validierung von INSPECTR als Nachweisschema für virale Nukleinsäuren haben wir die Kompatibilität mit einem End-to-End-Workflow nachgewiesen, der die Lyse intakter Viruspartikel umfasste. Eine umfassende Untersuchung von Chemikalien und Reinigungsmitteln ergab eine Formulierung bestehend aus HCl und dem Reinigungsmittel LAPAO, die in der Lage ist, das SARS-CoV-2-Virus bei Raumtemperatur in weniger als 30 s vollständig zu lysieren, ohne die nachgelagerten Prozesse zu beeinträchtigen. Gammabestrahltes SARS-CoV-2 wurde seriell in Wasser verdünnt und entweder mit Lysereagenz behandelt oder direkt in die Ligations-, Amplifikations- und Expressionsreaktionen gegeben. Wie in Abb. 6c dargestellt, enthält der Bestand an intakten Viruspartikeln keine zugängliche RNA und führt zu keinem Signal auf dem Lateral-Flow-Streifen. Durch die Einbeziehung des Lyseschritts kann der Assay 11 fM Virus in der Ligationsreaktion nachweisen.

INSPECTR ist ein Ansatz zur Entwicklung einer programmierbaren molekularen Diagnostik, die kostengünstig und mit instrumentenlosen Arbeitsabläufen kompatibel ist. Die Kerntechnologie ist die zielvermittelte Ligation von DNA-Sonden, die, sobald sie verbunden sind, eine Expressionskassette bilden, die in einem zellfreien Expressionssystem transkribiert und übersetzt wird, um einen gewünschten Reporter zu produzieren. Die Sonden können so gestaltet werden, dass sie jede gewünschte Peptid- oder Proteinausgabe erzeugen. Die Auswahl der Auslesung erfolgt daher entsprechend den gewünschten Eigenschaften des Assays, unabhängig vom interessierenden Nukleinsäureziel.

In der einfachsten Ausführungsform von INSPECTR kodieren die Sonden für ein Fragment eines katalytischen Enzyms (LacZ), das zu einer qualitativ sichtbaren Farbänderung führt, die für einen Endbenutzer leicht interpretierbar ist (Extended Data Abb. 2). Obwohl die resultierende kolorimetrische Ausgabe ohne Instrumentierung sichtbar ist, ist ihr linearer Betriebsbereich eng und die Nachweisgrenze ist ohne Verstärkung hoch. Anschließend haben wir einen quantitativen INSPECTR-Assay für den Einsatz in Umgebungen entwickelt, die einen Lumineszenzdetektor ermöglichen. Unser Nanoluciferase-Assay verfügt über einen linearen Bereich (R2 = 1), der vier Größenordnungen der Zielkonzentration in einem diagnostisch relevanten Bereich von 1 fM bis 10 pM abdeckt (Abb. 3). Wir fanden heraus, dass die Empfindlichkeit des Assays ausreichte, um das SARS-CoV-2-Virus im menschlichen Speichel nachzuweisen (ergänzende Abbildung 3), obwohl die Linearität der Assay-Reaktion durch die Rohmatrix beeinflusst wurde.

INSPECTR ermöglicht eine einzigartige Multiplexing-Fähigkeit, die durch die Expression von Dual-Epitop-Peptiden anstelle von Enzymen erreicht wird. Nach der Entwicklung einer Bibliothek von Dual-Epitop-Peptiden und Nachweisantikörpern haben wir gezeigt, dass ein hochmultiplexierter Lateral-Flow-Streifen zum gleichzeitigen Nachweis von Sequenzen von fünf Atemwegsviren in einem einzigen Assay verwendet werden kann. Die Entwicklung zusätzlicher Dual-Epitop-Peptid- und Detektionsantikörper könnte ein Multiplexing höherer Ordnung über den in dieser Arbeit gezeigten 5-Plex-Assay hinaus ermöglichen. Zusätzliche Vorteile inerter Peptide bestehen darin, dass sie klein und leicht zu synthetisieren sind und keine funktionellen Domänen haben, die durch die Insertion der dem Ziel entsprechenden Aminosäuresequenz zerstört werden könnten, wodurch sie leicht anpassbar sind. Da diese Peptide jedoch inert sind, fehlt ihnen die Fähigkeit zur Signalverstärkung und sie erreichen nicht die Empfindlichkeit katalytischer Enzyme. Um dieses Problem anzugehen, haben wir gezeigt, dass INSPECTR mit einem vorgeschalteten Amplifikationsschritt bei Umgebungstemperatur gekoppelt werden kann, um die Empfindlichkeit zu verbessern und den Nachweis von 3,5 fM genomischer SARS-CoV-2-RNA (4.000 RNA-Kopien) mit einer Lateral-Flow-Auslesung zu ermöglichen. Während die Berichte über die analytische Sensitivität molekularer und antigenbasierter Diagnosetests je nach Testhersteller und der jeweiligen Studie stark variieren2,51, kann festgestellt werden, dass die Sensitivität von INSPECTR zwischen der von Antigen-Schnelltests (billig, aber nicht empfindlich) und PCR-Tests (sehr empfindlich, aber teuer und hoch instrumentiert). Wichtig ist, dass der gesamte Prozess in allen Fällen bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden kann.

Wir haben gezeigt, dass die INSPECTR-Technologie eine Reihe von Funktionen ermöglicht, darunter visuelle Auslesung, Quantifizierung, hohe Empfindlichkeit und Multiplexing. Der modulare Ansatz und die Entkopplung der Ziel-Nukleinsäuresequenz von der Aminosäure-Ausgabesequenz machen INSPECTR zu einer äußerst flexiblen Strategie für die dezentrale Diagnostik. Die Verwendung von Zellextrakten in INSPECTR bietet mehrere Vorteile. Diese äußerst kostengünstigen biochemischen Reagenzien sind leicht programmierbar, können durch Gefriertrocknung für eine Langzeitlagerung (länger als 1 Jahr) ohne Kühlung stabilisiert werden52 und haben sich nachweislich in komplexen Matrices wie Speichel, Urin und Blut bewährt25,53, 54. Sie behalten ihre erhebliche Aktivität bei Raumtemperatur und wenn sie getrocknet und in kostengünstige Materialien wie Papier eingebettet sind20. Allerdings kann keines der demonstrierten Ergebnisse alle diese Fähigkeiten gleichzeitig erreichen, und die Anzahl der Benutzerschritte und die Zeit bis zum Ergebnis bleiben Hindernisse für ihre Einführung am Ort des Bedarfs. Versuche, die Anzahl der Benutzerschritte zu reduzieren (d. h. Eintopf-Ligation und zellfreie Expression), wurden durch die Inkompatibilität zwischen den einzelnen biochemischen Reaktionen behindert (Extended Data, Abb. 3). Wir haben auch beobachtet, dass eine Verringerung der Dauer einer einzelnen Reaktion zu einer geringeren Assay-Empfindlichkeit führt (ergänzende Abbildung 4). Obwohl die aktuelle INSPECTR-Technologie ohne Instrumentierung auskommt und eine Empfindlichkeit aufweist, die den meisten Antigen-Schnelltests überlegen ist, sind weitere Anstrengungen erforderlich, um eine ausgereifte Diagnoselösung zu realisieren, die eine Empfindlichkeit auf PCR-Ebene und eine einfache Anwendung auf Antigenebene erreicht, um ihre Verwendung zu ermöglichen ungeschulte Benutzer am Ort des Bedarfs. Eine zusammenfassende Tabelle der Vor- und Nachteile jedes untersuchten Reporterproteins ist in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Obwohl wir uns auf den Nachweis viraler RNA-Ziele konzentriert haben, um diese Konzepte zu beweisen, funktioniert die Methode genauso gut bei denaturierten DNA-Zielen (Extended Data Abb. 2). Der Nutzen von INSPECTR muss sich auch nicht auf die Diagnostik von Infektionskrankheiten beschränken. Es könnte auch verwendet werden, um eine therapeutische Reaktion hervorzurufen – beispielsweise die Expression antimikrobieller Peptide, die durch den Nachweis einer bakteriellen Infektion ausgelöst wird. Angesichts der Fähigkeit häufig verwendeter Ligasen, zwischen Nukleotiden an der Ligationsverbindung zu unterscheiden42,55, wäre INSPECTR für den Nachweis von Einzelnukleotid-Polymorphismen im Zusammenhang mit der Krebsdiagnostik nützlich. Wir glauben, dass diese neue Implementierung der synthetischen Biologie und zellfreier Systeme überall dort breite Anwendung finden kann, wo eine kostengünstige und dezentrale Nukleinsäureerkennung von Wert ist.

Der zellfreie Extrakt wurde intern wie zuvor beschrieben hergestellt38. Glycerinvorräte (1 ml) des angegebenen Stamms wurden verwendet, um eine 1-l-Kultur eines der definierten Medien für die Extraktzubereitung BL21 Star (DE3) zu inokulieren (1,5 g l−1 Ammoniumsulfat, 4,6 g l−1 dibasisches Kaliumphosphat, 1 g l− 1 Kaliumchlorid, 3 g l−1 Trinatriumcitrat-Dihydrat, 1 g l−1 l-Asparagin, 1,4 g l−1 l-Glycin, 0,27 g l−1 l-Histidinhydrochlorid-Monohydrat, 0,7 g l−1 l-Isoleucin, 0,7 g l−1 l-Leucin, 0,6 g l-1 l-Lysinhydrochlorid-Monohydrat, 0,28 g l-1 l-Methionin, 0,28 g l-1 l-Phenylalanin, 0,92 g l-1 l-Prolin, 0,73 g l-1 l-Threonin, 0,28 g l-1 l-Tryptophan, 0,34 g l-1 l-Tyrosin, 0,45 g l-1 l-Valin, 0,65 g l-1 Betainhydrochlorid, 0,02 g l-1 Eisenchlorid-Hexahydrat, 28,6 mg l-1 Cholinchlorid, 25,1 mg l-1 Niacin, 25,6 mg l-1 p-Aminobenzoesäure-Kaliumsalz, 9,4 mg l-1 Pantothensäure-Hemicalciumsalz, 1,5 g l-1 Pyridoxinhydrochlorid, 3,9 mg l-1 Riboflavin, 17,7 mg l-1 Thiaminhydrochlorid, 0,1 mg l-1 Biotin , 0,1 mg l−1 Cyanocobalamin, 0,07 mg l−1 Folsäuredihydrat, 3,5 mg l−1 Natriummolybdat, 3,9 mg l−1 Zinksulfatheptahydrat, 1,2 mg l−1 Borsäure, 3,4 mg l−1 Kobalt (II ) Chlorid-Hexahydrat, 3,4 mg l-1 Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat, 1,9 mg l-1 Mangan(II)-sulfat, 0,2 g l-1 Magnesiumsulfat, 5 g l-1 Glucose, 5 g l-1 Hefeextrakt und Salzsäure pH 7,2) oder 2X YTP + G (für DH10β, 16 g l−1 Trypton, 10 g l−1 Hefeextrakt, 5 g l−1 Natriumchlorid, 7 g l−1 dibasisches Kaliumphosphat, 3 g l−1 monobasisches Kaliumphosphat, 5 g l −1 Glukose).

Die Kulturen wurden in einem 2,5-l-Tunair-Kolben bis zu einer anfänglichen optischen Dichte (OD600) von 0,2 beimpft. Die Kulturen wurden auf einem Schüttler bei 37 °C und 225 U/min inkubiert, bis sie eine optische Dichte zwischen 4 und 5 erreichten. Der Kolben wurde 30 Minuten lang auf Eiswasser gekühlt und dann 30 Minuten lang bei 6.000 × g bei 10 °C zentrifugiert, um Pellets zu bilden die Zellen. Die Pellets wurden durch Vortexen in 30 ml S30-Puffer (10 mM Tris-Acetat, 14 mM Magnesiumacetat, 60 mM Kaliumacetat, pH 8,2) vollständig resuspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten lang bei 4 ° C mit 6.000 × g erneut zentrifugiert und der Überstand entfernt. Der Waschvorgang mit 30 ml wurde wiederholt. Nach der dritten Zentrifugation wurden die Pellets in flüssigem Stickstoff schockgefroren und über Nacht oder bis zur Verwendung gelagert. Um Extrakte herzustellen, wurden die Pellets auf Eis in 1,25 ml S30-Puffer pro Gramm Zellpellet aufgetaut und vollständig resuspendiert. Die Zellen wurden durch Homogenisierung auf einem Avestin EmulsiFlex-C3-Homogenisator lysiert und mit S30-Puffer in drei Durchgängen bei 10–15.000 psi voräquilibriert. Das Lysat wurde zur Klärung 30 Minuten lang bei 4 ° C und 18.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und bei 37 °C unter Schütteln bei 140–200 U/min für eine ribosomale Ablaufreaktion 30 Minuten lang inkubiert. Der geklärte Extrakt war der Überstand einer weiteren Zentrifugation bei 18.000 × g für 30 Minuten bei 4 °C, wurde auf flüssigem Stickstoff schockgefroren und zur Langzeitlagerung bei –80 °C gelagert.

Die Basis-CFE-Reaktionen unter Verwendung kommerzieller zellfreier Expressionskits wurden mit den folgenden Zusammensetzungen durchgeführt:

NEBExpress: 12,5 % S30-Syntheseextrakt und 25 % Proteinsynthesepuffer (E5360, New England Biolabs (NEB)), 9 U µl−1 T7 RNAP (M1019B, NEB), 0,8 U µl−1 muriner RNase-Inhibitor (M0314S, NEB) .

PURExpress: 28 % Lösung A, 21 % Lösung B (E6800, NEB), 0,8 U µl−1 muriner RNase-Inhibitor (M0314S, NEB).

Die Basis-CFE-Reaktionen unter Verwendung von hauseigenem Lysat wurden mit der folgenden Zusammensetzung durchgeführt: 12,5 % Extrakt (v/v), 0,6 mM Adenosintriphosphat (AAJ6033622, Thermo Fisher), 0,6 mM GTP (AAJ1680003, Thermo Fisher), 0,15 mM Cytidintriphosphat (AAJ62238-03, VWR), 0,15 mM Uridintriphosphat (ICN19123091, Thermo Fisher); 34 µg ml-1 Folinsäure (47612, Sigma), 170 µg ml-1 E. coli tRNA (10109550001, Sigma), 2 mM jede Aminosäure (VWR), 33,33 mM Phosphoenolpyruvat (AAB2035822, Thermo Fisher), 0,33 mM NAD (AAJ6233706, Thermo Fisher), 0,27 mM CoA (102588-436, VWR), 2,7 mM Kaliumoxalat (223425, Sigma), 1 mM Putrescin (D13208, Sigma), 1,5 mM Spermidin (AAAA19096-22, VWR), 10 mM Ammoniumglutamat, 10 mM Magnesiumglutamat (49605, Sigma), 105 mM Kaliumglutamat (AAA17232-30, VWR), 27 U µl−1 T7 RNAP (M1019B, NEB), 30 µg ml−1 GamS-Nukleaseinhibitor (P0774S, NEB ), 0,8 U µl−1 muriner RNase-Inhibitor (M0314S, NEB) und die angegebene DNA-Konzentration.

Für die Messung des LacZ-Reporters wurden zusätzlich 0,75 mM Chlorphenolrot-β-d-galactopyranosid (59767, Sigma) und 55 nM LacZ-Omega-Fragment (P2010005, Molecular Depot) zu 30-µl-Reaktionen hinzugefügt, deren Absorption bei 576 kontinuierlich überwacht wurde nm jede Minute auf einem BioTek Gen5 (Software v3.11) Plattenlesegerät auf einer versiegelten (AB0558, Thermo Fisher) schwarzen Platte mit klarem Boden (3764, Corning). Die angegebene Zeit bis zur Absorption = 1 wurde durch lineare Interpolation berechnet. Als Ausgangsstamm zur Herstellung des Extrakts wurde DH10β verwendet, da ihm genomisches LacZ in voller Länge fehlt, was andernfalls zu einem sehr hohen Hintergrund führen würde.

Für die Messung des nLuc-Reporters im Lysat wurde den Reaktionen 1 % v/v Nano-Glo-Luciferase-Substrat (N1110, Promega) zusammen mit 10 % Polyethylenglykol (PEG)-8000 (1546605, Sigma) und 20 % PURExpress zugesetzt Lösung B (zur Verbesserung der Translation), was die Reaktionsempfindlichkeit weiter erhöhte. Bei den gemeldeten Daten handelt es sich um die höchste gemeldete Lumineszenz im Verlauf eines 2-stündigen Experiments bei Raumtemperatur und im 10-µl-Maßstab, die kontinuierlich jede Minute auf einer versiegelten weißen Platte mit 384 quadratischen Vertiefungen (4513, Corning) überwacht wird. Die Proteinproduktion wurde anhand einer linearen Kalibrierungskurve unter Verwendung von gereinigtem nLuc geschätzt. BL21 Star (DE3) war der Quellstamm für die Expression von nLuc in Abb. 1. Für die HiBiT-Experimente in den ergänzenden Abbildungen. 3 und 6, zusätzlich wurde eine 0,5 Vol.-% gereinigte LgBiT-Untereinheit verwendet (Promega N3030).

gBlock-Genfragmente, die die nLuc-Varianten kodieren, wurden bei Integrated DNA Technologies (IDT) bestellt. Lineare Expressionstemplates für die Varianten wurden mithilfe von PCR-Primern generiert, die an den T7-Promotor und den T7-Terminator der Expressionskassetten annealten, und die PCR-Produkte wurden mit dem PureLink PCR-Reinigungskit (K310001, Invitrogen) gereinigt und mit dem Take3-Assay quantifiziert. Varianten wurden durch Inkubation von 2 fM der verdünnten linearen Expressionsvorlage in einem Reaktionsvolumen von 10 µl unter Verwendung des hauseigenen BL21 Star (DE3)-Extrakts gescreent.

Die ssDNA-Sonden A (NG15) und B (NG16) wurden bei GenScript bestellt. Ligationsreaktionen wurden in einem Reaktionsvolumen von 5 µl durchgeführt, das 1x T4-RNA-Ligasepuffer (B0216L, NEB), 7 % v/v PEG 3350, 1 U µl-1 muriner RNase-Inhibitor (M0314L, NEB), 65 ng µl-1 Extreme enthielt thermostabiles einzelsträngiges DNA-Bindungsprotein (ET SSB; M2401S, NEB), 840 nM SplintR-Ligase (M0375S, NEB), 9 mM Dithiotreitol, 500 nM Rückwärtsprimer (zur Initiierung der Doppelstrangbildung vom 3'-Terminus), 3,8 nM Sonde A und 380 pM Sonde B. Die linearen Sondenkonzentrationen wurden gewählt, um das Signal zu maximieren und Leckagen zu reduzieren; Die Erhöhung der Sonde B, aber nicht der Sonde A auf 3,8 pM führte zu einem höheren Leck, und wir haben die Sondenkonzentration wo möglich maximiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von genomischer SARS-CoV-2-RNA oder synthetischer RNA in den angegebenen Konzentrationen initiiert und dann 30 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert. Nach der Ligation wurde ein 10 µl CFE-Reaktionsmastermix mit 40 % v/v PureExpress-Lösung A, 30 % PureExpress-Lösung B (E6800L, NEB), 0,38 U µl−1 IsoPol (71500-201, ArcticZymes), 1,5x Nano- Glo-Substrat (PRN1110, Promega), 0,15 mM Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) und 7,5 mM EDTA wurden direkt zur 5 µl-Ligationsreaktion gegeben. Die Lumineszenz wurde auf einem BioTek Gen5-Plattenlesegerät (Softwareversion 3.11) bei Umgebungstemperatur 20 Minuten lang gemessen und der höchste gemessene Wert wird angegeben. Die nichtlineare Anpassung nach der Methode der kleinsten Quadrate wurde anhand der logarithmisch transformierten x- und y-Werte im Bereich von 10–105 fM Ziel-RNA berechnet. Das Ausgabemodell (log LUMINESCENCE) = m1 log (RNA/fM) + b1) ergab 95 % CI-Parameter m1 = (1,102,1,125), b1 = (0,004555,0,1202) und R2 = 1,000 aus 15 Datenpunkten. Wir haben auch ein linear-lineares Modell über die gesamte Domäne berechnet, wobei LUMINESCENCE = m2 (RNA/fM) + b2, mit 95 % CIs m2 = (0,9381,0,9493), b2 = (1,938,6,541) und R2 = 0,9999.

Zum Nachweis klinischer Proben in der ergänzenden Abbildung 5 wurden die Speichelproben 30 s lang mit 20 mM NaOH-Lösung vorbehandelt und anschließend in der Ligationsreaktion mit einer 4 mM HCl-Lösung neutralisiert. Anschließend ließ man die Ligationsreaktionen wie oben beschrieben ablaufen.

Synthetische SARS-RNA-Fragmente wurden bei IDT bestellt und die vollständige synthetische RNA-Sequenz wurde durch Zusammenlegen der RNA-Fragmente rekonstituiert. Genomische SARS-RNA wurde aus in Vero-Zellen (0810587CFHI, Zeptometrix) kultivierten Viruspartikeln unter Verwendung des PureLink Viral DNA/RNA-Kits (12280050, Invitrogen) gemäß dem Herstellerprotokoll gereinigt.

Zur Herstellung des Detektionsantikörperkonjugats wurde der Anti-Strep-Tag-II-Antikörper (Klon 5A9F9, A01732, Genscript) in 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,4 (DSKR, NanoComposix) gepuffert. Fünf ml 150 nm große Carboxyl-Gold-Nanoschalen (20 OD) wurden mit 400 µg 1-Ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid, gefolgt von 800 µg Sulfo-N-hydroxysuccinimid, aktiviert und dann in Reaktionspuffer (5) resuspendiert mM Kaliumphosphatpuffer mit 0,5 % PEG (20 kDa, pH 7,4)). Pufferausgetauschter Antikörper (75 µg) wurde 4X in Reaktionspuffer verdünnt und 1 Stunde lang mit aktivierten Nanoschalen inkubiert. Nach der Antikörperkopplung wurde das Konjugat mit Blockierungspuffer (0,5X PBS, 5 % BSA, 0,5 % Casein, 1 % Tween 20, 0,05 % Natriumazid, pH 8) 1 Stunde lang blockiert. Blockiertes Konjugat wurde mit Reaktionspuffer gewaschen und dann mit Konjugat-Verdünnungspuffer (0,5X PBS, 0,5 % BSA, 0,5 % Casein, 1 % Tween 20, 0,05 % Natriumazid, pH 8) auf 20 OD resuspendiert.

Die universellen Lateral-Flow-Streifen (Abb. 2b, 4a und 6) wurden durch Laminieren eines absorbierenden Kissens (CF5, Cytiva) auf eine 22 mm breite Nitrozellulosemembran (FF120HP, Cytiva) und eine Trägerkarte (KN-PS1045.DEV) hergestellt , Kenosha-Tapes). Mit einem Reagenzspender (XYZ3060, Biodot) wurden Antikörper mit einer Geschwindigkeit von 1 µl cm−1 gestreift: Die Anti-Maus-Kontrolllinie (0,5 mg ml−1 in PBS, A28174, Thermo Fisher) wurde 17 mm vom Boden entfernt gestreift der Nitrozellulose und eine Anti-FLAG-Testlinie (1 mg ml−1 in PBS, Klon M2.1, cAb6404-1.1, Absoluter Antikörper) wurde 12 mm vom Boden der Nitrozellulose entfernt gestreift. Die 7-Plex-Teststreifen (Abb. 4b) wurden auf ähnliche Weise hergestellt, indem das absorbierende Kissen auf eine 45 mm breite Nitrozellulosemembran und eine Trägerkarte laminiert wurde. Anti-HA-Antikörper (Klon 5E11D8, A01244-100, Genscript), Anti-Ty1-Antikörper (Klon BB2, MA5-23513, Thermo Fisher) und Anti-OLLAS-Antikörper (Klon L2, NBP1-0673, NovusBio) wurden auf 0,5 mg ml resuspendiert 1 in PBS; Anti-V5 (Klon SV5-Pk1, R960-25, Invitrogen), Anti-S-tag (Klon GT727, SAB2702227, Sigma Aldrich), Anti-VSV-G (Klon P5D4, ab50549, Abcam) und Anti-Myc (Klon 9E10, M4439, Sigma Aldrich) Antikörper wurden in einen Striping-Puffer (0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8 mit 2 % Trehalose und 5 % Saccharose) gepuffert. Die Antikörper wurden im Abstand von 5 mm bei 1 µl cm-1 in der folgenden Streifenreihenfolge gestreift: Anti-Maus (C), Anti-Ty1 (T7), Anti-HA (T6), Anti-VSV-G (T5), Anti -S-Tag (T4), Anti-Myc (T3), Anti-V5 (T2) und Anti-OLLAS (T1). Für den 5-Plex-Teststreifen (Abb. 5) wurden die Antikörper in der folgenden Reihenfolge gestreift: Anti-Maus (C), Anti-FLAG (T5), Anti-Ty1 (T4), Anti-VSV-G (T3) , Anti-S-Tag (T2) und Anti-V5 (T1). Gestreifte Membranen wurden 1 Stunde lang bei 37 °C getrocknet und mit einem Guillotinenschneider (CM5000, Biodot) in 4 mm breite Streifen geschnitten.

Um den universellen Nachweis eines Dual-Epitop-Reporters mit 3x-FLAG (N-Terminus) und Twin-Strep-Tag (C-Terminus) zu bewerten (Abb. 2b und 4a), 10 pM Expressionskassette (verschiedene dsDNA-gBlocks, IDT) wurde mit 10 µl PURExpress (Abb. 2b und 4a) und einem hauseigenen Extrakt aus BL21 Star (DE3) (Abb. 2b) Expressionsreaktionen versetzt. Expressionsreaktionen wurden 2 Stunden lang bei 22 °C inkubiert. Nach der Expression wurden alle Reaktionsprodukte dann mit 25 µl phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Tween-20 (PBST) und 5 µl Nachweiskonjugat auf ein Endvolumen von 40 µl verdünnt und in eine nicht bindende 96-Well-Platte mit flachem Boden gegeben. Dann wurde ein universeller Lateral-Flow-Streifen in die Reaktion eingebracht; Eine sichtbare Testlinie zeigte eine Sandwich-Einbindung des Dual-Epitop-Peptids mit der Anti-FLAG-Testlinie und dem Anti-Strep-Tag-II-Nachweisantikörper-Konjugat an.

Um den Multiplex-Nachweis von 7 Dual-Epitop-Peptiden (Abb. 4b) zu bewerten, wurde eine 30-µl-Expressionsreaktion bestehend aus 0,73X S30-Syntheseextrakt (P0864B, NEB), 0,73X Proteinsynthesepuffer (B0864B, NEB) und 13,2 U µl-1 durchgeführt T7-Polymerase (M1019B, NEB), 1,17 U µl-1 RNAse-Inhibitor (M1018B, NEB) und 143 pM Expressionskassette (custom gBlocks, IDT) wurden 2 Stunden lang bei 22 °C inkubiert. Das ausgedrückte Produkt (27 µl) wurde mit 5 µl Nachweiskonjugat und PBST auf ein Endvolumen von 40 µl gemischt. Anschließend wurde ein 7-Plex-Lateralflussstreifen in die Reaktion eingebracht; Sichtbare Testlinien deuteten auf einen Sandwich-Einfang des Dual-Epitop-Peptids mit peptidspezifischen Einfangtestlinien und einem Anti-Strep-Tag-II-Nachweis-Antikörper-Konjugat hin.

Um den Multiplex-Nachweis von 5 RNA-Zielen zu bewerten (Abb. 5), wurden zielspezifische Sonden miteinander ligiert, um die Bildung von Expressionskassetten zu initiieren. Ligationsreaktionen (12 µl) enthielten 4 % w/v PEG 3350 (1008055, Rigaku Reagents), 1 U µl−1 RNAse-Inhibitor (M1018B, NEB), 0,0325 µg µl−1 ET SSB (M2401B-HC1, NEB), 1X SplintR-Ligasepuffer (B0375S, NEB), 0,84 µM SplintR-Ligase (M0375B-HC1, NEB), 0,5 µM Rückwärtsprimer (Ergänzungstabelle 1, IDT) und 10 nM jeder Ziel-RNA. Die Ligationsreaktionen wurden 30 Minuten lang bei 22 °C inkubiert. Das Ligationsprodukt (10 µl) wurde dann zu einem endgültigen Expressionsreaktionsvolumen von 30 µl hinzugefügt, das 0,73X S30-Syntheseextrakt (P0864B, NEB), 0,73X Proteinsynthesepuffer (B0864B, NEB), 13,2 U µl-1 T7-Polymerase ( M1019B, NEB), 1,17 U μl-1 RNAse-Inhibitor (M1018B, NEB), 100 μM dNTPs (N0447L, NEB) und 33,3 U ml-1 Bsu-DNA-Polymerase (M0330L, NEB) und 2 Stunden bei 22 °C inkubiert . Das ausgedrückte Produkt (27 µl) wurde mit 5 µl Nachweiskonjugat und PBST auf ein Endvolumen von 40 µl gemischt. Anschließend wurde ein 5-Plex-Lateralflussstreifen in die Reaktion eingebracht; Man ging davon aus, dass sichtbare Testlinien auf einen Sandwich-Einfang des Dual-Epitop-Peptids mit peptidspezifischen Einfangtestlinien und einem Anti-Strep-Tag-II-Nachweis-Antikörper-Konjugat hinweisen.

Für jede genomische RNA-Konzentration wurde eine 7 µl-Ligationsreaktion unter Verwendung von 840 nM SplintR-Ligase (M0375B-HC1, NEB), 1X SplintR-Reaktionspuffer, 32,4 ng µl−1 ET SSB (M2401B-HC1, NEB) und 1 U µl− vorbereitet 1 muriner RNase-Inhibitor (M0314L, NEB), 4 % PEG 3350 (1008055, Rigaku Reagents), 1,5 nM zirkularisierbare und 5′-phosphorylierte ssDNA-Sonde, 15 nM 5′-phosphoryliertes GFO und 2 µl der angegebenen Konzentration an SARS-gRNA. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 22 °C auf einem Thermocycler inkubiert. Anschließend wurde Exonuklease I (M0293B-HC1, NEB) bis zu einer Endkonzentration von 2,5 U µl−1 zugegeben und die Reaktion 5 Minuten lang bei 22 °C weiter inkubiert.

RCA-Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 12 µl vorbereitet, bestehend aus 6 µl Ligationsprodukt, 1 mM dNTPs (N0447L, NEB), 1X Φ29-Puffer, 1 U µl−1 Φ29 DNA-Polymerase (M0269B-HC1, NEB) und 40 µM Random Hexamer-RCA-Primer mit 2X Phosphorothioat-Verknüpfungen am 3'-Terminus. Die Reaktion wurde 2 Stunden lang bei 22 °C inkubiert.

Die Expression des amplifizierten RCA-Produkts erfolgte mit dem zellfreien E. coli-Proteinsynthesesystem NEBExpress (E5360L, NEB) in einem Gesamtvolumen von 30 µl, bestehend aus 10 µl des RCA-Produkts, 0,73X S30-Syntheseextrakt (P0864B, NEB). ), 0,73X Proteinsynthesepuffer (B0864B, NEB), 13,2 U µl-1 T7-Polymerase (M1019B, NEB), 1,17 U µl-1 RNAse-Inhibitor (M1018B, NEB), 1,2 U µl-1 muriner RNase-Inhibitor und 0,5 mg ml-1 Lachssperma-DNA (15632011, Invitrogen) und 2 Stunden bei 22 °C inkubiert.

Um die Dual-Epitop-Peptide sichtbar zu machen, wurden 27 µl des exprimierten Produkts mit 5 µl Detektionskonjugat und PBST auf ein Endvolumen von 40 µl gemischt und auf einen Lateral-Flow-Streifen aufgetragen. Ein zweiseitiger t-Test für ungepaarte Mittelwerte unter Verwendung der Welch-Korrektur für ungleiche Varianzen wurde zwischen den Bedingungen 0 und 3.500 Uhr (N = 8 bei jeder Bedingung) durchgeführt und ergab t = 9,770 und angepasstes df = 7,045 (P < 0,0001).

Um den Nachweis intakter Viruspartikel zu demonstrieren, wurde als Virus gammabestrahltes SARS-CoV-2 (NR-52287, BEI Resources) verwendet. Für den Zustand ohne Lyse wurde jede Viruskonzentration wie oben beschrieben direkt zur Ligationsreaktion gegeben. Für die lysierten Proben wurde jede Konzentration zunächst durch Inkubation in einem Lysereagenz bestehend aus 20 mM HCl, 0,1 % LAPAO (L360S, Anatrace) und 1 U µl−1 RNAsin (N2511, Promega) für 30 s bei Raumtemperatur vorbehandelt , und dann durch Zugabe von 100 mM Tris-Cl (pH 9,0) neutralisiert, bevor es dem Ligationsgemisch hinzugefügt wird. Der Arbeitsablauf verlief dann genau wie oben für den gRNA-Nachweis beschrieben.

Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, das den Test beschreibt, finden Sie unter Protocol Exchange mit dem Titel „INSPECTR-Testprotokoll für empfindliches SARS-CoV-2, aktiviert durch Rolling-Circle-Amplifikation“.

Alle Teststreifen wurden 20 Minuten lang entwickelt und dann gescannt (V850 Pro-Scanner, Epson); Die mittleren Grauwerte der Testlinien und des Hintergrunds (25 Pixel unterhalb der Testlinie) wurden mit ImageJ 1.53t gemessen. Die resultierende „angepasste Testlinienintensität“ wurde dann wie folgt berechnet

Dabei steht 0 für die geringstmögliche Pixelintensität (d. h. Schwarz).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle zur Bewertung der Schlussfolgerungen erforderlichen Daten finden Sie im Papier und in den Zusatzinformationen. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken I. Azmi, K. Cholkar und D. Paszkowski für die Herstellung des hauseigenen zellfreien Extrakts; H. Boisvert für seine Unterstützung bei der Optimierung der Proteinexpression und für seine Beiträge beim Verfassen von Manuskripten; L. Carlson für seine Unterstützung bei der Optimierung der Proteinexpression; M. Wilson für Screening-Assay-Komponenten und für Beiträge zum Assay-Design und zum Verfassen von Manuskripten; J. Lo, S. Singh und M. Desmond für ihre Unterstützung bei den Screening-Assay-Komponenten; JR Swartz von der Stanford University für Anleitungen zur Herstellung zellfreier Extrakte und zur Proteinexpression; MB Frieman von der University of Maryland für die Bereitstellung genomischer SARS-RNA für frühe INSPECTR-Experimente. Sherlock Biosciences gibt bekannt, dass die Good Venture Foundation und die Bill and Melinda Gates Foundation (Fördernummer 022787) die in dieser Studie beschriebene Forschung unterstützen.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Elizabeth A. Phillips, Adam D. Silverman, Aric Joneja.

Sherlock Biosciences, Watertown, MA, USA

Elizabeth A. Phillips, Adam D. Silverman, Aric Joneja, Michael Liu, Carl Brown, Paul Carlson, Christine Coticchia, Kristen Shytle, Alex Larsen, Nadish Goyal, Vincent Cai, Jason Huang, Jennifer E. Hickey, Emily Ryan, Joycelynn Acheampong , Pradeep Ramesh & William J. Blake

Wyss Institute for Biological Inspired Engineering, Harvard University, Boston, MA, USA

Carl Brown, James J. Collins und William J. Blake

Institut für Medizintechnik und Wissenschaft, Abteilung für Biotechnik, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

James J. Collins

Programm für Infektionskrankheiten und Mikrobiome, Broad Institute of MIT und Harvard, Cambridge, MA, USA

James J. Collins

Abdul Latif Jameel Clinic for Machine Learning in Health, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

James J. Collins

College of Arts and Sciences, Harvard University, Cambridge, MA, USA

James J. Collins

Zentrum für synthetische Biologie, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

James J. Collins

Harvard-MIT-Programm für Gesundheitswissenschaften und Technologie, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

James J. Collins

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EAP und ADS konzipierten und gestalteten die Experimente, führten die Experimente durch, analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. AJ konzipierte und gestaltete die Experimente, analysierte die Daten und schrieb das Manuskript. CB und PC konzipierten und gestalteten die Experimente, führten die Experimente durch, analysierten die Daten und redigierten das Manuskript. ML, CC, KS, NG, JH, JEH, ER und JA planten und führten Experimente durch und analysierten die Daten. AL, VC und PR entwarfen Experimente und analysierten die Daten. JJC und WJB konzipierten und gestalteten die Experimente.

Korrespondenz mit Aric Joneja.

Alle Autoren außer JJC sind derzeit bei Sherlock Biosciences beschäftigt oder waren zuvor dort beschäftigt. JJC ist Mitbegründer von Sherlock Biosciences.

Nature Biomedical Engineering dankt Harry Larman, Jeong Wook Lee und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Schematische Darstellung der in dieser Studie verwendeten HiBiT-Sonde. Wir haben dieses Expressionssystem als Modell für die Ligationseffizienz ausgewählt, da die Sonde eine ähnliche Struktur und Länge wie die Dual-Epitop-Peptidsonden aufweist, aber eine quantitative Anzeige liefert, ähnlich wie Nanoluciferase56. b, Expressionskassettentitration für dsDNA, die die ligierte HiBiT-Sonde kodiert. Die aufgezeichneten Daten (N = 2) stellen die einzelnen Punkte und den Durchschnitt der 2-stündigen Endpunktlumineszenz nach der Expression im selbst hergestellten BL21 Star (DE3)-Extrakt dar. c, Zieltitration für RNA auf der HiBiT-Sonde. Eine SARS-CoV-2-Targeting-Sonde wurde mit der Ligationsverbindung in der 5'-UTR entworfen, da das HiBiT-Peptid selbst nur aus 11 AAs besteht. Die Ligation wurde 30 Minuten lang durchgeführt, gefolgt von zwei Stunden zellfreier Expression. d, Schematische Darstellung von HiBiT-Sonden mit 0 (vorligiert), 1 oder 2 Ligationsverbindungen (einschließlich des lückenfüllenden Oligos). Die Verbindungen wurden so konzipiert, dass sie innerhalb der kodierenden Sequenz des Peptids auftreten, sodass nicht ligierte Produkte kein nachweisbares Expressionsleck aufweisen. e, Das Hinzufügen einer zweiten Splint-Verbindung für eine einzelne Ziel-RNA verringert das Signal einer quantitativen HiBiT-Sonde um etwa das Zweifache und f, erhöht die Konzentration des ligierten Ziels um etwa ein CT, gemessen durch quantitative PCR. Die Sonden wurden 30 Minuten lang in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 nM Ziel-RNA ligiert.

Quelldaten

a, Schematische Darstellung der kolorimetrischen INSPECTR-Reaktion. Die Sonden „A“ und „B“ wurden an einer Hybridisierungsregion gespalten, die auf die Sense-Sequenz von SARS-CoV-2 abzielt. Um die Synthese des LacZ-Gens voller Länge auf einer einzelsträngigen Sonde zu vermeiden, wurde die Sonde stattdessen so konzipiert, dass sie nur das LacZ-Alpha-Fragment exprimiert, das sich mit dem gereinigten Omega-Fragment ergänzt, um das intakte Enzym zu produzieren, wie zuvor beschrieben. Da das LacZ-Alpha-Peptid klein ist, haben wir es nicht gespalten und stattdessen die Hybridisierungsregion unmittelbar nach dem Startcodon im selben Leserahmen wie die kodierende Sequenz platziert. (Wir haben festgestellt, dass dieses Design kein nachweisbares Transkriptionsleck aufwies.) b, Nachweis von SARS-CoV-2-Nukleinsäuresequenzen mithilfe kolorimetrischer INSPECTR-Sonden. 10 nM der LacZ-Sonde wurden entweder mit der SARS-CoV-2-RNA-Sequenz oder der entsprechenden DNA in der angegebenen Konzentration schienenligiert; Anschließend wurden 3 µL zu 7 µL CFE-Reaktionen unter Verwendung eines zellfreien Extrakts hinzugefügt, der aus DH10β-E.-coli-Zellen hergestellt wurde, zusammen mit gereinigtem LacZ-Omega-Fragment und Chlorphenolrot-Galactopyranosid (dem Reaktionssubstrat). Links: Expressions- und Komplementationskinetik von N = 2 unabhängigen Ligations- und Expressionsreaktionen unter Verwendung der angegebenen Konzentration an DNA- oder RNA-Zielen. Rechts: repräsentative Bilder der Reaktionsendpunkte (18 Stunden), aufgenommen mit dem iPhone.

Quelldaten

a, Schematische Darstellung der Eintopf-Ligation-Zweitstrang-Synthese. Wenn die Synthese des zweiten Strangs schneller ist als die der Ligase, ist die einzelsträngige Verbindung für die SplintR-Ligase nicht zugänglich. Gemessen sowohl durch b, zellfreie Expression als auch c, qPCR unter Verwendung von Primern, die die Ligationsverbindung überspannen, sowie durch zellfreie Expression behindert die Zugabe von exogenem DNAP, das zur Erzeugung einer transkribierbaren Expressionskassette erforderlich ist, die Splint-Ligation der Funktionssonde.

Quelldaten

Ergänzende Abbildungen und Tabellen sowie unbearbeitete Lateral-Flow-Streifen.

Sequenzen für alle in dieser Arbeit verwendeten Nukleinsäuren.

Quelldaten für die ergänzenden Abbildungen.

Quelldaten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Phillips, EA, Silverman, AD, Joneja, A. et al. Nachweis viraler RNAs bei Umgebungstemperatur über Reporterproteine, die durch die zielgerichtete Ligation von DNA-Sonden erzeugt werden. Nat. Biomed. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01028-y

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Eingegangen: 11. Juli 2022

Angenommen: 25. März 2023

Veröffentlicht: 04. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01028-y

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Nachweis viraler RNAs bei Umgebungstemperatur über Reporterproteine, die durch das Ziel produziert werden