Der Hefe-Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor Sec7 ist ein Engpass bei der räumlichen Proteinqualitätskontrolle und entgiftet neurologische Krankheitsproteine

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 14068 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der ER-zu-Golgi-Handel beteiligt sich an der Sortierung fehlgefalteter zytoplasmatischer Proteine, um deren zytologische Toxizität zu verringern. Wir zeigen hier, dass Hefe Sec7, ein Protein, das an der Proliferation des Golgi beteiligt ist, Teil dieses Signalwegs ist und an einer Hsp70-abhängigen Bildung unlöslicher Proteinablagerungen (IPOD) beteiligt ist. Sec7 verbindet sich während eines leichten Hitzeschocks mit der Desaggregase Hsp104 und erhöht bei Überproduktion die Geschwindigkeit der Hsp104-Diffusion in Hsp70-abhängiger Weise. Die Überproduktion von Sec7 erhöhte die Bildung von IPODs aus kleineren Aggregaten und milderte die Toxizität von Huntingtin-Exon-1 bei Hitzestress, während die Depletion von Sec7 die Empfindlichkeit gegenüber aẞ42 der Alzheimer-Krankheit und α-Synuclein der Parkinson-Krankheit erhöhte, was auf eine Rolle von Sec7 bei der Abschwächung der Proteotoxizität schließen lässt.

Die Proteinqualitätskontrollmaschinerie (PQC) in der Zelle ist entscheidend, um Proteinsynthese, -faltung, -transport, -abbau und -sequestrierung in einem funktionellen Gleichgewicht (Proteostase) zu halten und Toxizität durch fehlerhafte Proteine ​​zu verhindern. Es besteht aus vielen aufeinander abgestimmten Signalwegen, die größtenteils durch die Wirkung molekularer Chaperone erleichtert werden. Es gibt eine Vielzahl von Stressfaktoren, die ein Ungleichgewicht in der Proteostase verursachen können, was zum Verlust oder Zugewinn von Proteinfunktionen und zur Störung zellulärer Prozesse führt1,2,3,4. Solche Stressfaktoren sind beispielsweise Hitzeschock und oxidativer Stress. Darüber hinaus spielt ein Zusammenbruch der Proteostase eine zentrale Rolle bei vielen altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich der Huntington-, Alzheimer- und Parkinson-Krankheit5,6,7,8; Krankheiten, die durch die Ansammlung toxischer Proteinoligomere und -aggregate gekennzeichnet sind.

Neurodegenerative Erkrankungen, der Abbau von PQC und die Proteinaggregation wurden mit Defekten im intrazellulären Vesikeltransport in Verbindung gebracht, die während des Alterns in verschiedenen Organismen auftreten9,10,11,12,13,14,15,16,17: Beispielsweise interagiert das Huntingtin-Protein mit Proteine, die am Vesikeltransport beteiligt sind18,19 und das Krankheitsprotein verursachen Defekte in der Endozytose12. In ähnlicher Weise wird die Aß-Prozessierung aus dem Amyloid-Vorläuferprotein (APP) durch den endolysosomalen Transport erleichtert und steht somit in direktem Zusammenhang mit verschiedenen Endomembransystemen, die bei der Alzheimer-Krankheit versagen10,11,17,20,21,22. Darüber hinaus ist bekannt, dass α-Synuclein der Parkinson-Krankheit den Membrantransport vermittelt, und Fehler bei diesem Transport spielen eine wichtige Rolle bei der α-Synuclein-Aggregation und der Ausbreitung von Krankheiten von Zelle zu Zelle16,23,24,25,26,27. Bei S. cerevisiae gibt es auch Hinweise darauf, dass der funktionelle Membrantransport für die Handhabung von α-Synuclein-Aggregaten wichtig ist26,28.

Zusätzlich zur Funktion des Endomembrantransports bei neurologischen Erkrankungen wurde bereits zuvor eine Rolle des endozytotischen Transports bei der Hefealterung, der Proteostase und der Lebensspannenkontrolle beschrieben29. Es ist bekannt, dass der Handel mit Hefevesikeln aus mehreren hochkonservierten, miteinander verbundenen Signalwegen besteht30,31,32, die eine ständige Kommunikation und einen ständigen Materialaustausch erfordern. Die Systeme befinden sich somit in unmittelbarer Nähe und stehen über zelluläre Organellen und verbindende Proteine ​​in Kontakt miteinander. Diese Transportwege bestehen aus dem Exozytose-/Sekretionsweg (SEC), der Proteine ​​zur Plasmamembran oder aus der Zelle heraus leitet, und den VPS- und ALP-Wegen, die die Ladung zur Vakuole leiten. Endozytose (END-Weg) ermöglicht die Aufnahme von Plasmamembranproteinen und Komponenten des extrazellulären Mediums, die nach der Internalisierung in Endosomen sortiert und zur Vakuole zum Abbau oder zum Golgi zur Wiederverwertung (RCY-Weg) geschickt werden. Die am Endomembrantransport beteiligten Pfade hängen von einer Vielzahl von Faktoren ab, darunter Rab-GTPasen und SNARE-Proteine ​​wie das Hefe-Syntaxin-5 Sed5, das am anterograden COPII-Transport vom ER zum Golgi beteiligt ist und kürzlich gezeigt wurde, dass es als räumlicher Engpass fungiert PQC (sPQC) in Hefe33.

Der sPQC sortiert fehlgefaltete Proteine ​​in verschiedene Organellen-assoziierte Stellen innerhalb der Zelle. Bei einem Hitzeschock sammeln sich fehlgefaltete Proteine ​​im Zytoplasma der Hefe zunächst an mehreren Stellen an, die als CytoQs bezeichnet werden und auch als Q-Körper oder Stressherde bekannt sind. Anschließend verschmelzen sie zu größeren Ablagerungsstellen, die üblicherweise als Einschlüsse bezeichnet werden34,35,36,37. Diese Einschlüsse sind an mindestens drei verschiedenen Stellen lokalisiert, die als juxtanukleare und/oder intranukleäre Qualitätskontrollstelle (JUNQ/INQ) bekannt sind; die periphere, vakuolenassoziierte unlösliche Proteinablagerung (IPOD); und eine Stelle neben den Mitochondrien33,35,38,39,40,41.

In diesem Artikel berichten wir, dass der Hefe-Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor Sec7, eine Schlüsselkomponente im Golgi-Handel42,43, einen zusätzlichen Engpass bei Hsp70-abhängigem sPQC darstellt, einschließlich der Bildung von Organellen-assoziierten Einschlüssen, und dass die Überproduktion von Sec7 den räumlichen Raum steigert Proteostase bei leichtem Hitzeschock und Alterung und mildert die Toxizität von Huntingtin Exon-1.

In einer kürzlich durchgeführten Studie haben wir die Rolle des Vesikelhandels und insbesondere des Hefe-Syntaxin-5 bei der Gewährleistung einer ordnungsgemäßen sPQC bei leichtem Hitzeschock aufgedeckt, indem wir die Bibliothek von Hefemutanten, bei denen nicht-essentielle Gene entfernt wurden, auf Defekte bei der Einschlussbildung untersuchen33. Hier haben wir ein ähnliches Screening durchgeführt, das die essentiellen Gene von Hefe umfasste, d. h. die Durchführung einer High-Content-Mikroskopie nach einem milden Hitzeschock und die Bestimmung, welche temperaturempfindlichen (ts) Mutantenstämme drei oder mehr Hsp104-GFP-Aggregate pro Zelle aufweisen (Typ-3-Mutante). statt der typischen ein bis zwei Einschlüsse. Die wichtigsten Funktionskategorien, die unter den wesentlichen Genen angereichert sind, die an der Bildung von Einschlüssen beteiligt sind (SAFE-Analyse44; Abb. 1a), sind Zellpolarität, Vesikelhandel, Chromatin/Transkription und Proteinumsatz (Abb. 1a). Die Rolle der Zellpolarität bei sPQC wurde bereits ausführlich untersucht45,46,47. Beim Screening der nicht-essentiellen Mutantenbibliothek wurde auch der Vesikelhandel als funktionelle Kategorie unter den Treffern angereichert33 und bestätigt, dass diese Kategorie an der sPQC endogener Proteinaggregate bei Hitzeschock beteiligt ist. Zu den identifizierten Genen gehörten bekannte Faktoren, die für eine ordnungsgemäße sPQC erforderlich sind, wie das essentielle Syntaxin-5 und Komponenten des COG-Komplexes (Ergänzungstabelle 133). Zusätzlich zur Analyse der Daten aus dem Hitzeschock nach 110 Minuten als Endpunkt haben wir uns vorgenommen, ts-Allele zu finden, die zu einem längeren Versagen der Aggregatkoaleszenz führen, indem wir die Anzahl der Aggregate pro Zelle auch zu späteren Zeitpunkten, 220 und 330 Minuten, überwachten. Durch den Vergleich des späten (330 Min.) mit dem frühen Zeitpunkt (110 Min.) des Hitzeschocks konnten wir Mutationen identifizieren, die zu einem drastischen Versagen der sPQC führten (Ergänzungstabelle 2).

Es wurde festgestellt, dass Sec7 neben anderen Vesikeltransportkomponenten die richtige räumliche PQC bei Hitzeschock aufrechterhält. (a) SAFE-Analyse, Bild modifiziert von TheCellMap.org, Treffer für Typ-3-Zellen bei kontinuierlichem Hitzeschock für 110 Minuten unter Verwendung der essentiellen Gen-Hefe-Mutantenbibliothek. (b) Fraktion von Typ 3 in WT- und sec7-1-Mutantenzellen bei kontinuierlichem Hitzeschock (38 °C, 90 Min.). (c) Aggregatphänotyp von WT- und sec7-1-Zellen (38 °C, 90 min), repräsentative Zellen aus (b). (d) Fraktion von Typ 3 bei kontinuierlichem Hitzeschock (38 °C, 90 Min.) in WT-Zellen, die SEC7 überproduzieren, im Vergleich zur Vektorkontrolle (unter Verwendung des 316-SEC7-mRFP-Plasmids (ADH1-Promotor)). (e) Aggregatphänotyp von WT-Zellen ohne und mit Überproduktion von Sec7 (38 °C, 90 min, repräsentative Zellen aus (d). Bilder sind maximale Z-Projektionen relevanter Schnitte mit konsistenter Helligkeits-/Kontrastanpassung über die Stämme innerhalb der Abbildung . Maßstabsbalken 2 μm.

Das essentielle SEC7, das eine Rolle bei der Golgi-Reifung/Proliferation und dem Intra-Golgi-Handel spielt, wurde aufgrund seines Typ-3-Phänotyps und weil es zuvor als physikalischer Interaktor von Hsp104 bei zulässigen Temperaturen und darüber hinaus gefunden wurde, für die weitere Analyse unter den Treffern ausgewählt also während eines leichten Hitzeschocks29. Bedingte sec7-1-Mutantenzellen zeigten schwere Defekte bei der Bildung von IPOD-Einschlüssen und beherbergten stattdessen mehrere (drei oder mehr), kleinere Aggregate (Abb. 1b, c) und verringerten nur die Anzahl der Hsp104-GFP-Foci-freien Zellen bei anhaltender Hitze Schock um 17 %. Es gehörte somit zu den stärkeren Treffern von Mutanten mit eingeschränkter Fähigkeit, die Hsp104-assoziierte Aggregation bei längerem Hitzestress zu lindern. Wir haben getestet, ob Sec7 die IPOD-Bildung einschränkt, indem wir es auf einem Plasmid überproduzierten (Abb. 1d, e) und indem wir seinen nativen Promotor gegen den starken, konstitutiven GPD-Promotor austauschten (ergänzende Abb. 1a). Wir fanden heraus, dass eine solche Überproduktion die IPOD-Bildung aus kleinen Aggregaten drastisch erhöhte, dh die Anzahl der Typ-3-Zellen verringerte, was darauf hindeutet, dass Sec7 in Wildtyp-Zellen für sPQC limitierend ist. Ein Zusammenhang zwischen Sec7 und der Sekretion in sPQC wurde weiter durch die Behandlung von Zellen mit Brefeldin A, einem Inhibitor von Sec7 und anderen Sekretionsfaktoren, bestätigt (ergänzende Abbildung 1b). Um festzustellen, ob Sec7 und Sed5 in sPQC über denselben Weg wirken, führten wir Aggregat-Clearance-Assays mit dem Sec7-Überproduktionsstamm durch (ergänzende Abbildung 1c). Im Gegensatz zu dem starken Anstieg der Clearance, der in SED5-Überexpressionszellen33 beobachtet wurde, wurde bei Überexpression von SEC7 kein solcher Effekt festgestellt, was darauf hindeutet, dass die Überproduktion jedes der beiden Faktoren möglicherweise nicht dieselben sPQC-Wege fördert oder dass quantitativ unterschiedliche Schwellenwerte für das Erreichen einer Wirkung vorliegen Für die beiden Proteine ​​liegt eine aggregierte Clearance vor. Darüber hinaus haben wir über Plasmide Sec7 in sed5-1 und Sed5 in sec7-1-bedingt mutierten Zellen überproduziert und festgestellt, dass die bei der Einschlussbildung in jedem Mutanten beobachteten Defekte durch eine solche Überproduktion nicht unterdrückt werden konnten (ergänzende Abbildung 1d). Dies deutet darauf hin, dass Sed5 und Sec7 bei der Steigerung von sPQC nicht in parallelen redundanten Signalwegen funktionieren, da ihre Funktion auf die gegenseitige Anwesenheit angewiesen ist. Eine andere Erklärung wäre, dass Sed5 und Sec7 zusammenarbeiten, um die Einschlussbildung zu erhöhen.

Als nächstes fragten wir uns, ob die positiven Auswirkungen der Sec7-Überproduktion auf die Einschlussbildung durch ihre wesentliche Rolle bei der Autophagie50 erklärt werden könnten, da Autophagie zum Abbau fehlerhafter Proteine ​​beiträgt. Um dieses Problem anzugehen, haben wir getestet, ob die Zunahme der Einschlussbildung, die durch Sec7-Überproduktionszellen angezeigt wird, vom Vorhandensein des essentiellen Autophagiefaktors Atg1 abhängt. Die Überexpression von SEC7 konnte die Einschlussbildung auch im atg1∆-Hintergrund steigern (ergänzende Abbildung 1e). Darüber hinaus haben wir die Vakuolenmorphologie in WT-, sec7-1- und SEC7-überexprimierenden Zellen, die Vph1-GFP enthielten, vor und nach einem Hitzeschock visualisiert. In Übereinstimmung mit früheren Daten51 vergrößerte sich die Vakuolenfläche in WT-Zellen während eines Hitzeschocks bei gleichzeitiger Abnahme der Vakuolenzahl. Während der bedingte Sec7-1-Mutant bei Hitzeschock einen Anstieg der Anzahl kleiner Vakuolen aufwies, was auf Defekte in der Vakuolendynamik hinweist, blieb der Sec7-Überproduktionsstamm davon unberührt (ergänzende Abbildung 1f). Insgesamt deuten die Daten darauf hin, dass die Wirkung von Sec7 in sPQC unabhängig von seiner Funktion bei der Autophagie ist.

Es wurde bereits früher gezeigt, dass eine erhöhte IPOD-Bildung mit einer erhöhten Bewegung der Disaggregase Hsp104 (verkürzte Diffusionszeit 33;) verbunden ist, die spezifisch an Proteinaggregate bindet und für deren ordnungsgemäße Disaggregation erforderlich ist52,53,54. Daher untersuchten wir mithilfe der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), ob die Überproduktion von Sec7 die Hsp104-Diffusion beeinflusst. Wir fanden heraus, dass die Diffusionszeit verkürzt wurde, wenn Sec7 überproduziert wurde (Abb. 2a). Darüber hinaus erforderte dieser Effekt von Sec7 auf die Bewegung von Hsp104 die Anwesenheit eines der wichtigsten zytosolischen Hsp70-Chaperone Ssa1 und Ssa2 (Abb. 2b, c), was interessant ist, da Hsp70 für die Funktionen von Hsp104 bei der Proteinqualitätskontrolle erforderlich sind. 56. Sec7 bildet Herde auf Golgi-assoziierten beschichteten Vesikeln und wir fanden heraus, dass solche Sec7-Herde und Hsp104-assoziierten Aggregate bei leichtem Hitzeschock vorübergehend kolokalisiert waren und dass diese Kolokalisierung sowohl von Ssa1 als auch von Ssa2 abhängig war (Abb. 2d, e, ergänzend). Abb. 2). Darüber hinaus war Ssa1 oder Ssa2 für die Überproduktion von Sec7 erforderlich, um die IPOD-Bildung aus kleineren Aggregaten zu erhöhen (Abb. 2f, g).

Die Überproduktion von Sec7 erhöht die dynamische Bewegung von Hsp104 in Hsp70-abhängiger Weise. (a) Diffusionszeit von löslichem Hsp104-GFP in WT-Zellen ohne und mit Überproduktion von Sec7 (38 °C). (b) Diffusionszeit von löslichem Hsp104-GFP in ssa1Δ-Zellen ohne und mit Überproduktion von Sec7 (38 °C). (c) Diffusionszeit von löslichem Hsp104-GFP in ssa2∆-Zellen ohne und mit Überproduktion von Sec7 (38 °C). Für (a–c) Der untere und obere Rand der Box stellen das erste und dritte Quartil dar. Der Kreis zeigt den Mittelwert und die Whiskers zeigen die Variabilität der Diffusionszeiten außerhalb des oberen und unteren Quartils für 15–25 Zellen an. (d) Anteil der Zellen, die bei Hitzeschock in WT-Zellen (38 °C) eine Co-Lokalisierung von Hsp104-GFP mit Sec7-RFP zeigen. Zellen mit einem sichtbaren Signal in beiden Kanälen (grün und rot) wurden hinsichtlich ihrer Co-Lokalisierung bewertet. (e) Co-Lokalisierung von Hsp104-GFP mit Sec7-RFP nach 30 Minuten Hitzeschock in WT-Zellen. (f) Fraktion von Typ 3 bei kontinuierlichem Hitzeschock (38 °C, 90 min) in ssa1∆-Zellen, die SEC7 im Vergleich zur Vektorkontrolle überexprimieren. (g) Fraktion von Typ 3 bei kontinuierlichem Hitzeschock (38 °C, 90 min) in ssa2Δ-Zellen, die SEC7 im Vergleich zur Vektorkontrolle überexprimieren.

Da Sec7 die Bildung von Einschlüssen während eines milden Hitzeschocks zu begrenzen schien, untersuchten wir als Nächstes, ob dies auch bei der replikativen Alterung der Fall war. Es wurde gezeigt, dass sich Proteinaggregate während der replikativen Alterung von Hefe-Mutterzellen ansammeln58,59 und dazu neigen, in alten Mutterzellen mehrere Aggregate statt diskreter Einschlüsse zu bilden60,61. Wir isolierten alte Mutterzellen (durchschnittlich 13 Knospennarben) und verglichen ihren Gesamtgehalt mit und ohne Sec7-Überproduktion. Wir fanden erstens heraus, dass die Überproduktion von Sec7 die Anzahl der Mutterzellen verringerte, die irgendeine Art von Aggregat aufwiesen (Abb. 3a), und zweitens, dass alte Zellen, die Aggregate enthielten, weniger Aggregate aufwiesen, wenn Sec7 überproduziert wurde (Abb. 3b, c). Wir fanden jedoch keinen Einfluss der Sec7-Überproduktion auf die Lebensdauer der Zellen (Abb. 3d).

Die Überproduktion von Sec7 steigert die räumliche PQC während der replikativen Alterung. (a) Anteil gealterter Zellen, die Hsp104-GFP-Aggregate in WT-Zellen ohne und mit Überproduktion von Sec7 aufweisen. (b) Anteil der Typ-3-Zellen im WT ohne und mit Überproduktion von Sec7. (c) Anzahl der Aggregate pro gealterter Zelle des WT (gezählt in 449 Zellen) und SEC7 OE-Stämme (gezählt in 544 Zellen). (d) Replikative Lebensdauer von WT und SEC7 OE.

Es wurde gezeigt, dass das Huntingtin-Exon-1, Htt103Q-Polyglutaminpeptid, der Huntington-Krankheit auch in Hefezellen toxisch ist18,62,63. Angesichts der Wirkung von Sec7 auf sPQC testeten wir, ob die Überproduktion von Sec7 die Htt103Q-Toxizität beeinflusst, und stellten fest, dass dies sowohl bei Flüssigkeits- als auch bei Plattenwachstumstests der Fall ist (Abb. 4a, b). Das Flüssigkeitswachstumsprofil zeigt, dass die Sec7-Überproduktion die Wachstumsrate während der exponentiellen Wachstumsphase auf Vektorkontrollniveaus bei erhöhter Temperatur rettet, selbst wenn die SEC7-Überexpressionszellen bei 24-stündiger Wachstumsüberwachung nicht die gleiche Ausbeute wie die Vektorkontrolle erreichen ( Abb. 4a). Darüber hinaus zeigen Sec7-überproduzierende Zellen in Wachstumstests auf Platten eine erhöhte zelluläre Fitness im Vergleich zu Wildtyp-Zellen, die Htt103Q enthalten, insbesondere bei höheren Temperaturen (Abb. 4b), was darauf hindeutet, dass die Überproduktion von Sec7 die Toxizität dieses Krankheitsproteins deutlich verringert. Sec7-1-Zellen reagieren jedoch nicht empfindlicher auf die Htt103Q-Expression als WT-Zellen (ergänzende Abbildung 3a). Wir haben keine offensichtlichen Veränderungen in der Aggregation von Htt103Q in den SEC7-Überexpressionszellen oder in der bedingten Sec7-1-Mutante im Vergleich zu WT beobachtet (ergänzende Abbildung 3b).

Sec7 beeinflusst die Toxizität von Proteinen neurodegenerativer Erkrankungen. (a) Wachstumsprofil in flüssigen Medien von WT- und SEC7-OE-Zellen, die über den GPD-Promotor (103Q) Htt103Q überproduzieren, im Vergleich zur Vektorkontrolle (pRS416), gemessen mit einem automatischen Plattenlesegerät. (b) Fitness von WT- und SEC7-OE-Zellen, die über den GPD-Promotor (Htt103Q) Htt103Q überproduzieren, im Vergleich zur Vektorkontrolle (pRS416). (c) Fitness von WT- und sec7-1-Mutantenzellen, die aβ42 (pRS416-GPD-aβ42) überproduzieren, im Vergleich zur Vektorkontrolle (pRS416). (d) Fitness von WT- und sec7-1-Mutantenzellen in Abwesenheit (pYX242) oder Anwesenheit von α-Synuclein (WT SYN, A30P).

Wir haben mehrere Konstrukte von zwei anderen menschlichen Krankheitsproteinen, aβ42 und α-Synuclein der Alzheimer- bzw. Parkinson-Krankheit, getestet. Erstens verwendeten wir Varianten der Proteine, die in Hefezellen nicht oder nur sehr mäßig toxisch sind17,33 und stellten fest, dass Zellen mit reduzierter Sec7-Aktivität im Gegensatz zu Wildtypzellen eine Empfindlichkeit gegenüber diesen beiden Proteinen zeigten (Abb. 4c, D). Zweitens wurden zusätzliche Konstrukte dieser Krankheitsproteine ​​mit bekannter Toxizität in Wildtyp-Zellen in SEC7-Überexpressionszellen getestet. α-Synuclein und seine Punktmutation A53T-Version sind beide toxisch, wenn sie konstitutiv in hohen Mengen über 2μ-Plasmide exprimiert werden, und wir fanden heraus, dass die Überproduktion von Sec7 die Toxizität dieser Konstrukte nicht verbessern konnte und die Aggregation der Modellproteine ​​nicht beeinflusste (ergänzende Abbildung 3c, d). ). In ähnlicher Weise verwendeten wir GAL-induzierbare Konstrukte des Wildtyps aβ42, der mäßig toxisch ist, und seiner hochtoxischen Punktmutantenversion G37C65. Erhöhte Sec7-Spiegel konnten die Toxizität nicht abschwächen, wenn die Expression von Krankheitsproteinen durch wachsende Zellen auf Galactose induziert wurde (ergänzende Abbildung 3e). Wir haben getestet, ob eine Überexpression von SEC7 eine potenziell auftretende Toxizität von konstitutiv überexprimiertem aβ42 während der Zellalterung in Kulturen in der stationären Phase abschwächen kann. Es wurde jedoch kein Unterschied zwischen WT- und Sec7-überproduzierenden Zellen beobachtet, die aβ42 enthielten, im Gegensatz zu denen, die Htt103Q exprimierten (ergänzende Abbildung 3f). Wir spekulieren, dass erhöhte Sec7-Spiegel möglicherweise nicht in der Lage sind, die Entgiftung von α-Synuclein und aβ42 zu unterstützen, da diese beiden Krankheitsproteine ​​mit dem Sekretionsweg interagieren und diesen behindern. Im Gegensatz zu diesen Krankheitsproteinen hemmt mutiertes Huntingtin die Sekretion möglicherweise nicht auf diese Weise, sodass die Überproduktion von Sec7 auf den Signalweg einwirken und eine Resistenz gegen dieses Protein bewirken kann.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass aktuelle Daten die Rolle des ER-Golgi-Transports bei der Weiterleitung fehlgefalteter Proteine ​​an die Oberfläche von Vakuolen und Mitochondrien hervorgehoben haben und dass Vesikel des Transportwegs als Plattformen dienen können, auf denen fehlgefaltete und aggregierte Proteine ​​per Anhalter zu bestimmten Ablagerungsstellen gelangen können29,33 .66 inklusive IPODs. Eine solche Ablagerung von Aggregaten an der Oberfläche von Mitochondrien beschleunigt deren Entfernung aus der Zelle und diese Ablagerung beruht auch auf Proteinen, von denen bekannt ist, dass sie Kontaktstellen zwischen Vakuolen und Mitochondrien herstellen33. Darüber hinaus ist bekannt, dass Mängel bei der Endozytose und beim Vesikeltransport im Allgemeinen die Zellen empfindlicher gegenüber beschädigten Proteinen, einschließlich Proteinen neurologischer Erkrankungen, machen12,19. Hier zeigen wir, dass Sec7, ein Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor, der für die Reifung und Proliferation des Golgi sowie den Intra-Golgi-Transport erforderlich ist, ein Schlüsselfaktor für die Lenkung fehlgefalteter Proteine ​​zur IPOD-Ablagerungsstelle ist. Darüber hinaus scheint Sec7 ein limitierender Faktor bei solchen sPQC zu sein, da die ektopische Erhöhung der Proteinspiegel nicht nur die IPOD-Bildung fördert, sondern auch die Toxizität von Huntingtin-Exon-1 bei Hitzestress abschwächt. Es muss noch untersucht werden, ob Sec7-Golgi-bezogene Funktionen mechanistisch für die beobachteten Auswirkungen auf sPQC verantwortlich sind oder ob Sec7 möglicherweise über andere Wege auf sPQC einwirkt. Daher könnten Sec7 und damit verbundene Faktoren, die an der Golgi-Aufrechterhaltung beteiligt sind, interessante Ziele für die therapeutische Intervention altersbedingter Proteopathien sein.

Wie zuvor beschrieben33, wurden Stämme mit HSP104-GFP-LEU2 im S228C-SGA-Hintergrund (synthetisches genetisches Array) im Screening zur Bildung von Einschlusskörpern sowie in manuellen Aggregatassays verwendet und stammen aus einer gemäß der SGA-Technologie67 durchgeführten Kreuzung zwischen dem Y7092-SGA Abfragestamm mit HSP104-GFP-LEU2 und der essentiellen Genhefebibliothek Version 5, sofern nicht angegeben ist, dass der BY4741-Hintergrund verwendet wurde. Die SEC7-Überexpression in BY4741 wurde mit pYM-N1568 erzeugt. ATG1 wurde mit pFA6-hphNT168 gelöscht. Die C-terminale Region von Vph1-GFP-HIS3 wurde aus genomischer DNA des GFP-Sammelstamms69 mittels PCR amplifiziert und in das WT-, sec7-1- und SEC7-OE-Genom integriert. Detaillierte Informationen zu Stämmen und Plasmiden sind in der Ergänzungstabelle S3 aufgeführt.

Hefezellen wurden in synthetischen Drop-out-Medien, ergänzt mit 2 % Glucose und entsprechenden Antibiotika, oder in YPD gezüchtet. Die Zellen wurden bei 30 °C kultiviert, mit Ausnahme der temperaturempfindlichen Stämme, die bei 22 °C gehalten wurden.

Ein genomweites SGA-Screening wurde wie zuvor beschrieben67 unter Verwendung eines BM3-BC-Koloniehandhabungsroboters (S&P Robotics Inc.) durchgeführt.

Zellen aus der temperaturempfindlichen Mutantensammlung Version 5 (Boone lab, Toronto, Kanada) wurden mit dem Abfragestamm Y7092, der HSP104-GFP-LEU2 enthält, gekreuzt. Das neue Array wurde in synthetischen Vollmedien bis zu einer OD600 ̴ 0,5 bei 22 °C gezüchtet und anschließend in einem Wasserbad auf 38 °C gebracht. Die Zellen wurden gesammelt und live zu den Zeitpunkten 110 und 330 Minuten Hitzeschock unter Verwendung des ImageXpress Micro XLS-Systems (Molecular Devices) mit einem 100-fach-Objektiv (CFI L Plan EPI cc 0 mm bis 0,7 mm) und einem GFP-Filter (Anregung 472/472) abgebildet. 30 nm, Emission 520/35 nm, dichroitischer Spiegel 495 nm). Die Bilder wurden auf Anzahl der Zellen und Anzahl der Aggregate analysiert, wobei ein Algorithmus verwendet wurde, der mit der MetaXpress-Software (Version 6.54.532, Molecular Devices) erstellt wurde, der die Bilder segmentiert und Formmasken beibehält, um Bereiche außerhalb der Zellen bei der Bestimmung der Aggregatzahl auszuschließen. Mutanten galten als Treffer, wenn die Zellen nach 110-minütiger Hitzeeinwirkung durchschnittlich 3 oder mehr Hsp104-GFP-Aggregate pro Zelle (Typ-3-Phänotyp) enthielten. Die Treffer wurden mithilfe des browserinternen Tools TheCellMap.org 70 auf funktionelle Anreicherungen (SAFE44) analysiert, indem die Genliste der Treffer hochgeladen und der Signifikanzgrenzwert auf 5e-2 festgelegt wurde. Mutanten mit längerem Versagen der sPQC wurden identifiziert, indem der Prozentsatz der Aggregate pro Zelle bestimmt wurde, der nach 330 Minuten Hitzeschock im Vergleich zum anfänglichen Zeitpunkt von 110 Minuten nachweisbar war.

Die Zellen wurden in entsprechenden Medien, ergänzt mit 2 % Glucose, bei zulässiger Temperatur (30 °C/22 °C) bis zur mittleren exponentiellen Phase (OD600 ̴ 0,5) gezüchtet. Die Proteinaggregation wurde induziert, indem die Zellen 90 Minuten lang auf 38 °C gebracht wurden. Die Zellen wurden in Formaldehyd mit einer Endkonzentration von 3,7 % fixiert und mit PBS gewaschen. Z-Stapel-Bilder wurden mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop, einem inversen Zeiss Axio Observer .Z1-Mikroskop mit Axiocam 506-Kamera und einem Plan-Apochromat 100x/1,40 NA Oil DIC M27-Objektiv aufgenommen. Die Bilder wurden durch manuelles Zählen der Fraktionen von Typ-3-Zellen (die drei oder mehr Aggregate enthielten) in der ImageJ-Software quantifiziert. Vph1-GFP-haltige Zellen und solche, die Krankheitsproteinplasmide exprimieren, wurden direkt ohne Formaldehydfixierung abgebildet.

Alle Zahlendaten basieren auf dem Durchschnitt von mindestens drei Einzelexperimenten, wobei die Fehlerbalken die Standardabweichung darstellen. Die Daten wurden mithilfe eines ungepaarten zweiseitigen t-Tests auf Signifikanz getestet, wobei p-Werte < 0,05 als signifikant angesehen wurden, dargestellt als * < 0,05, ** < 0,005, *** < 0,0005.

Der Aggregat-Clearance-Assay wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt33.

Die Behandlung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt33.

Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt33. Kurz gesagt, die Messungen wurden mit einer ConfoCor2 FCS-Einheit durchgeführt, die an ein invertiertes konfokales LSM 880-Mikroskop (Zeiss) angeschlossen war, das mit einem C-Apochromat 40x/1,20 W Corr-Objektiv ausgestattet war. Um die Messposition im Zytoplasma jeder Zelle zu finden, wurden GFP (angeregt bei 488 nm, Emission bei 500–530 nm nachgewiesen) und der Übertragungskanal gleichzeitig mithilfe einer offenen Lochblende abgebildet. Die Messungen wurden 10 × 8 s lang mit Anregung bei 488 nm und Detektion bei 500–550 nm, Lochblende 1 AE, durchgeführt. Die Zellen wurden bis zur mittleren exponentiellen Phase (OD600 ~ 0,5) gezüchtet, 20 Minuten lang bei 38 °C einem Hitzeschock ausgesetzt und auf mit ConA behandelten Kulturschalen mit Glasboden befestigt, während die Inkubationskammer eine Temperatur von 38 °C hatte. In jeder Bedingung wurden 15–25 Zellen analysiert. Die 488-nm-Laserleistung wurde auf eine AOTF-Transmission von 0,005 % eingestellt. Die Anpassung der FCS-Autokorrelationskurven erfolgte mithilfe einer Einzelkomponenten-freien Diffusionsanpassung in der ConfoCor2-Software.

Zellen mit den angegebenen Reportern wurden in entsprechenden Medien, ergänzt mit 2 % Glucose, bei zulässiger Temperatur (30 °C/22 °C) bis zur mittleren exponentiellen Phase (OD600 ~ 0,5) gezüchtet. Anschließend wurde die Proteinaggregation bei 38 °C induziert. Die Co-Lokalisierung wurde während oder nach einem Hitzeschock zu den dargestellten Zeitpunkten untersucht.

Die replikative Lebensdaueranalyse wurde wie zuvor beschrieben71 durchgeführt. Kurz gesagt, Zellen der frühen logarithmischen Phase wurden ausplattiert und jungfräuliche Zellen wurden unter Verwendung des Mikromanipulators MSM400 (Singer Instruments) gemäß einem Gitter auf YPD-Platten angeordnet. Bei diesen Zellen handelte es sich um die designierten neuen Mutterzellen, deren Tochterzellen fortlaufend entnommen und bewertet wurden. Die Platten wurden bei 30 °C inkubiert und die Zellen wurden bei Raumtemperatur präpariert, bis sie aufhörten, sich zu teilen. Über Nacht wurden die Platten bei 4 °C aufbewahrt. Jede Analyse wurde unabhängig voneinander zweimal durchgeführt.

Stämme mit den angegebenen Plasmiden wurden in entsprechenden Medien, ergänzt mit 2 % Glucose, bei zulässiger Temperatur (30 °C/22 °C) bis zur mittleren exponentiellen Phase (OD600 ~ 0,5) gezüchtet. Die Kultur-ODs wurden auf 0,5 eingestellt und Reihenverdünnungen um den Faktor 10 wurden in Multiwell-Platten durchgeführt. Die Zellsuspensionen wurden auf die jeweiligen Drop-Out-Medienplatten getupft und bei den angegebenen Temperaturen zwei Tage lang inkubiert, sofern nicht anders angegeben.

Stämme mit den angegebenen Plasmiden wurden in -Ura-Dropout-Medium, ergänzt mit 2 % Glucose, bei zulässiger Temperatur (30 °C/22 °C) über Nacht gezüchtet und in 15 ml frischem Medium auf OD600 = 0,1 erneut verdünnt. Die Kulturen wurden für das Wachstum in die stationäre Phase bei 30 °C gehalten. Nach 3 Tagen und 10 Tagen Wachstum wurden 150 μl aus den Kulturen entnommen, seriell um den Faktor 10 verdünnt und auf die jeweiligen Drop-Out-Medienplatten getupft. Die Platten wurden 2 Tage lang bei 30 °C inkubiert und abgebildet.

Die Zellen wurden bei einer zulässigen Temperatur von 22 °C gezüchtet, bis sie die logarithmische Phase erreichten. Sie wurden erneut auf eine OD600 = 0,01 verdünnt und als 2–3 technische Replikate (Fehlerbalken sind SD) auf 24-Well-Platten angeordnet. Die Platte wurde 24 Stunden lang bei 37 °C im Plattenlesegerät BioTek Synergy 2 unter schnellem Schütteln inkubiert, während alle 15 Minuten Messungen des OD600 durchgeführt wurden.

Alte Zellen wurden mit der Magnetabin-Biotin-Streptavidin-Methode isoliert29,72,73. Mit Biotin markierte Zellen wurden isoliert, nachdem sie über Nacht gewachsen waren, bis OD600 < 1 war. Das durchschnittliche Replikationsalter der Zellen wurde durch manuelles Zählen der Knospennarben nach Fixieren der Zellen in 3,7 % Formaldehyd (Endkonzentration) und Anfärben mit Weizenkeim-Agglutinin-Alexa-Fluor-555-Konjugat (10) bestimmt mg/ml Endkonzentration, Life Technologies).

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem Artikel und seinen ergänzenden Datendateien enthalten. Anfragen zu Stämmen und Materialien sind an den entsprechenden Autor zu richten.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Joris Winderickx, Tiago Outeiro, Per Widlund, Dina Petranovic, Srishti Chawla und Charles Boone für die freundliche Bereitstellung von Hefestämmen und Plasmiden. Wir danken dem Center for Cellular Imaging der Universität Göteborg und der National Microscopy Infrastructure, NMI (VR-RFI 2019-00022, NMI00246) für die Unterstützung bei FCS. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Swedish Natural Research Council (VR) und der Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW; Grant and Wallenberg Scholar) an TN, von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) an AF und vom Swedish Cancer Fund unterstützt ( Cancerfonden) [CAN 2017/643 und 19 0069] und dem Schwedischen Naturforschungsrat (Vetenskapsrådet) [VR 2015-04984 und VR 2019-03604] an BL.

Open-Access-Finanzierung durch die Universität Göteborg.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Roja Babazadeh und Kara L. Schneider.

Institut für Biomedizin, Sahlgrenska-Akademie, Zentrum für Altern und Gesundheit – AgeCap, Universität Göteborg, 405 30, Göteborg, Schweden

Roja Babazadeh, Kara L. Schneider, Arthur Fischbach, Xinxin Hao und Thomas Nystrom

Abteilung für Chemie und Molekularbiologie, Universität Göteborg, Medicinaregatan 9 C, 413 90, Göteborg, Schweden

Beidong Liu

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RB, KLS, AF, XH, BL und TN haben die Experimente entworfen. RB, KLS, AF, XH und BL führten Experimente durch. RB, KLS, AF und TN analysierten die Experimente. TN und KLS haben das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Thomas Nystrom.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Babazadeh, R., Schneider, KL, Fischbach, A. et al. Der Hefe-Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor Sec7 ist ein Engpass bei der räumlichen Proteinqualitätskontrolle und entgiftet neurologische Krankheitsproteine. Sci Rep 13, 14068 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41188-0

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Eingegangen: 30. Januar 2023

Angenommen: 23. August 2023

Veröffentlicht: 28. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41188-0

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