Ein hocheffizientes Schema für die Bibliotheksvorbereitung aus einer Hand

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13913 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Obwohl Methoden zur Sequenzierung der Bibliotheksvorbereitung aus doppelsträngiger DNA gut etabliert sind, wurden Methoden aus einzelsträngiger DNA (ssDNA) nicht gut untersucht. Darüber hinaus weisen die bestehenden Methoden Einschränkungen hinsichtlich Effizienz und Ausbeute auf. Aus diesem Grund haben wir ein hocheffizientes Verfahren zur Sequenzierung der Bibliotheksvorbereitung aus ssDNA entwickelt. Bei dieser Methode wird die erste Adaptermarkierung von ssDNA mithilfe der durch terminale Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT) unterstützten Adenylat-Connector-vermittelten ssDNA-Ligation (TACS) durchgeführt, über die wir kürzlich berichtet haben. Nach der komplementären Strangsynthese unter Verwendung der mit dem Adapter markierten ssDNA wird die zweite Adaptermarkierung über eine auf Vaccinia-Virus-Topoisomerase I (VTopoI oder TOPO) basierende Adapterligation durchgeführt. Mit zusätzlichen Schritten zum Abbau, zur Unterdrückung und Entfernung des Adapterdimers ermöglicht das vorgeschlagene TACS-TOPO-Schema die Herstellung einer Adapterdimer-freien Sequenzierungsbibliothek aus ssDNA-Proben von 24 pg. Das TACS-TOPO-Schema wurde erfolgreich auf die zellfreie DNA-Analyse mit amplifikationsfreier Bibliotheksvorbereitung aus 50 µL menschlichem Serum angewendet. Ein modifiziertes TACS-TOPO-Schema wurde auch auf DNA angewendet, die aus alten menschlichen Knochen extrahiert wurde, was zu zwei- bis achtmal höheren Bibliotheksausbeuten führte als bei Verwendung eines herkömmlichen Bibliotheksvorbereitungsprotokolls. Die Verfahren zur Herstellung von VTopoI und seinem Komplex mit einem doppelsträngigen Oligonukleotidadapter werden ebenfalls beschrieben. Insgesamt kann das vorgeschlagene TACS-TOPO-Schema eine praktische und empfindliche Sequenzierungsanalyse von ssDNA erleichtern.

Obwohl viele effiziente Methoden zur Sequenzierung der Bibliotheksvorbereitung aus doppelsträngiger DNA (dsDNA)1,2,3 verfügbar sind, werden für einzelsträngige DNA (ssDNA) nur begrenzte Methoden beschrieben. Bisher wurden nur drei Hauptprinzipien für die Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung aus ssDNA festgelegt. Der erste Ansatz beinhaltet die durch terminale Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT) vermittelte homopolymere Anbindung an das 3′-Ende der ssDNA; Der Schwanz wird dann als Priming-Site verwendet, um die Ziel-ssDNA in dsDNA umzuwandeln, woraufhin der zweite Adapter mit T4-DNA-Ligase4 markiert wird. Die TdT-vermittelte Bibliotheksvorbereitung ist äußerst effizient, und einige Hersteller bieten Bibliotheksvorbereitungskits an, die auf diesem Prinzip basieren. Allerdings kann ein langer Schwanz ein Hindernis für die nachfolgende Sequenzierungsanalyse darstellen.

Die zweite Methode basiert auf der durch RNA-Ligase katalysierten ssDNA-Ligation, die einen 5′-phosphorylierten Adapter mit dem 3′-Ende der ssDNA verbindet. Beispielsweise etablierte Meyers Gruppe eine Methode basierend auf CircLigase II5,6. Nach der Adapterligation wird ssDNA in dsDNA umgewandelt, gefolgt von der Markierung des zweiten Adapters durch T4-DNA-Ligase. Obwohl RNA-Ligase zwei ssDNA-Moleküle verbinden kann, ist die Reaktionseffizienz auf weniger als einige Prozent begrenzt. Daher ist die Ausbeute der Bibliotheksvorbereitung mithilfe von RNA-Ligase eher begrenzt.

Der dritte Ansatz verwendet T4-DNA-Ligase für die ssDNA-Ligation7. Bei dieser Methode wird ein doppelsträngiger Adapter mit einem einzelsträngigen Zufallshexamer an einem Ende verwendet. Wenn das Zufallshexamer kompatibel mit dem Ende der Ziel-ssDNA hybridisiert ist, kann der Nick am teilweise doppelsträngigen Ende des Adapters mit T4-DNA-Ligase versiegelt werden. Dieses auf einer Schiene basierende Verfahren heißt ssDNA2.0 und zeigt eine höhere Effizienz als die auf CircLigase II basierende Methode7. Obwohl sowohl RNA-Ligase- als auch T4-DNA-Ligase-basierte Methoden saubere Verbindungen mit der Ziel-ssDNA herstellen können, müssen ihre geringen Effizienzen bei der Bibliotheksvorbereitung noch behoben werden.

Um die Vorbereitung der Sequenzbibliothek aus ssDNA zu verbessern, haben wir eine Technik für die effiziente Adaptermarkierung von ssDNA entwickelt, die als terminale Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT)-unterstützte Adenylat-Connector-vermittelte einzelsträngige (ss) DNA (TACS)-Ligation8 bezeichnet wird. Bei der TACS-Ligation wird die Ziel-ssDNA zunächst mit einigen Adenylaten unter Verwendung von TdT in einem Prozess namens Ribotailing versehen, gefolgt von einer RNA-Ligase-vermittelten Adaptermarkierung der ribotailierten ssDNA. Durch Ribotailing des 3′-Endes der ssDNA kann diese sich wie RNA verhalten, was die Effizienz der ssDNA-Ligation von RNA-Ligasen erheblich steigert. Dementsprechend ermöglicht die TACS-Ligation die Adaptermarkierung von mehr als 80 % des 3′-Endes der Ziel-ssDNA8. Bemerkenswert ist, dass die Tailing-Reaktion von TdT mit Ribonukleotiden nach der Verlängerung um 1–3 Nukleotide autoinhibiert wird9, was nur zu einer minimalen Unterbrechung der nachgeschalteten Sequenzierungsanalyse führt.

Die TACS-Ligation wurde kürzlich zur Analyse kurzer ssDNA in der zellfreien Fraktion von menschlichem Blut eingesetzt10. Nach der Adaptermarkierung von zellfreier DNA (cfDNA) mittels TACS-Ligation wurde die Ziel-ssDNA in dsDNA umgewandelt, gefolgt von einer zusätzlichen Adaptermarkierung mithilfe von T4-DNA-Ligase (TACS-T4-Schema). Die Ausbeute des TACS-T4-Schemas ist um ein Vielfaches höher als die der auf CircLibase II und T4-DNA-Ligase basierenden Methoden10.

Obwohl das TACS-T4-Schema verbesserte Bibliotheksausbeuten zeigte, weist das Protokoll einige praktische Probleme auf, darunter eine ineffiziente Markierung des zweiten Adapters und eine nicht zu vernachlässigende Adapterdimerbildung10. Obwohl die Effizienz der zweiten Ligation durch Reaktionsoptimierung gesteigert werden könnte, könnte dies gleichzeitig die Bildung von Adapterdimeren steigern. Die Bildung von Adapterdimeren könnte vermieden werden, wenn der nicht umgesetzte Adapter vor dem zweiten Ligationsschritt entfernt wird. Ein zusätzlicher Reinigungsschritt würde jedoch unweigerlich zum Verlust wertvoller DNA führen. Darüber hinaus ist die vollständige Entfernung des nicht reagierten Adapters sehr schwierig, insbesondere wenn der Größenunterschied zwischen Adapter und Produkt gering ist. Daher wollten wir eine alternative Methode mit reduzierter Dimerbildung und verbesserter Markierung des zweiten Adapters etablieren.

Zu diesem Zweck haben wir überlegt, ob die Adaptermarkierung auf Vaccinia-Virus-Topoisomerase I (VTopoI) besser funktionieren würde als die T4-DNA-Ligase, da die auf VTopoI basierende Ligation eine andere Richtung aufweist als die Ligation mit T4-DNA-Ligase: Die meisten DNA/RNA-Ligasen verbinden die 5′-phosphoryliertes Ende an den 3′-Hydroxyl-Terminus der Ziel-DNA, wohingegen VTopoI das 3′-phosphorylierte Ende aktiviert, um das 5′-Hydroxyl-Ende der Ziel-DNA zu verbinden. Aufgrund dieses Unterschieds in der Substratspezifität konnte VTopoI seine Substrat-DNA niemals mit dem 5′-phosphorylierten, nicht umgesetzten Adapter verbinden, der im ersten Adapter-Tagging-Schritt mit TACS-Ligation verwendet wurde.

Das für VTopoI kodierende Gen wurde erstmals 1987 von Stewart Shuman identifiziert11. Seitdem haben er und seine Kollegen seine Enzymeigenschaften eingehend untersucht12,13,14,15,16,17,18,19,20. VTopoI wurde 1994 als Werkzeug für das molekulare Klonen beschrieben21; Später wurde diese Technologie von Invitrogen (heute Thermo Fisher Scientific) kommerzialisiert. VTopoI wurde als effizientes Enzym zum Klonen von DNA-Fragmenten in Vektoren in der sogenannten TOPO-Klonierungstechnologie verwendet. Sobald der Vektor durch VTopoI aktiviert wird, kann er sich mit der Ziel-DNA verbinden und die Ligation erfolgt schnell, effizient und spezifisch. Aufgrund dieser Eigenschaften gilt das TOPO-Klonen als eine gute Wahl für die Einleitung des molekularen Klonens. Obwohl die Eigenschaften von VTopoI bei der Ligation für die Entwicklung neuer Technologien attraktiv erscheinen, haben begrenzte Studien die Verwendung von VTopoI als Enzym für die Ligation untersucht22.

In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Verwendung von VTopoI zur Vorbereitung von Bibliotheken für die Sequenzierung der nächsten Generation aus kurzer ssDNA in Kombination mit TACS-Ligation. Wir beschreiben Methoden zur Reinigung von VTopoI, zur Bildung des VTopoI-Oligonukleotid-(ODN)-Komplexes (VOC), zur Reinigung des VOC und dessen Anwendung zur Sequenzierung der Bibliotheksvorbereitung aus ssDNA (TACS-TOPO-Schema).

Das für VTopoI kodierende Gen (GenBank: L13447.1) wurde von Eurofins Genomics Inc (Tokio, Japan) synthetisiert, mit Codon-Optimierung für Escherichia coli K-12, Ausschluss interner BamHI- und EcoRI-Stellen und deren Einschluss an den 5′- und 3′-Enden der DNA (Ergänzungssequenzen). Das BamHI-EcoRI-Fragment des Gens wurde in die BamHI-EcoRI-Stelle von pColdTF, pColdI und pET28a subkloniert. Zur Herstellung der T4-Polynukleotidkinase (T4 PNK) verwendeten wir die Polymerasekettenreaktion (PCR), um das pseT-Gen des T4-Phagen aus genomischer DNA (T4 GT7-DNA, Nippon Gene, Tokio, Japan) mit BamHI- und EcoRI-Stellen an den 5′-Positionen zu amplifizieren. bzw. 3′-Enden (Ergänzungssequenzen) und klonierte es in die BamHI-EcoRI-Stelle von pColdI. Diese Konstrukte wurden in T7Express (New England Biolabs, Ipswich, MA) eingeführt und in Luria-Bertani-Brühe (LB)-Medium (1 % (w/v) Trypton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt und 0,5 % ( w/v) Natriumchlorid) mit 100 µg/ml Carbenicillin (für pColdTF und pColdI-Vektor, Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) oder 50 µg/ml Kanamycin (für pET28a, Fujifilm Wako Chemicals, Tokio, Japan).

Kultivierung von Bakterienzellen. Mit einem der Expressionsvektoren transformierte Bakterienzellen wurden in 3 ml LB-Medium mit Antibiotika inokuliert und über Nacht bei 37 °C unter kräftigem Schütteln kultiviert. Die Impfkultur wurde in einen 2-l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen, der 1 l LB-Medium mit Antibiotika enthielt, überführt und 4 Stunden lang unter Schütteln bei 37 °C weiter kultiviert. Für pColdI und pColdTF wurde der Kolben 30 Minuten lang in eiskaltem Wasser gekühlt und die Proteinexpression durch Zugabe von 238 mg Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Für pET28a wurde die Proteinexpression durch Zugabe von 238 mg IPTG induziert. Die Flaschen wurden über Nacht bei 16 °C (pColdI und pColdTF) oder 4 Stunden lang bei 37 °C (pET28a) unter kräftigem Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 2500 × g gesammelt und bis zur Verwendung bei –80 ° C gelagert.

Säulenreinigung rekombinanter Proteine. Bakterienzellen wurden in 20 ml HisTrap-Puffer A (20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 800 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 10 % Glycerin), der einen Proteaseinhibitor-Cocktail (Nacalai Tesque) enthielt, gelöst und aufgeschlossen durch Beschallung. Das Lysat wurde durch 15-minütige Zentrifugation bei 15.000 × g und Filtration durch einen 0,45-µm-Spritzenfilter geklärt. Die chromatographische Reinigung der ersten Runde wurde unter Verwendung einer 5-ml-HisTrap-HP-Säule (Cytiva, Marlborough, MA) mit HisTrap-Puffer A und HisTrap-Puffer B (20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 800 mM NaCl, 200 mM Imidazol, 1 mM DTT, und 10 % Glycerin). Die das Zielprotein enthaltende Fraktion wurde dann zehnfach mit Heparin-Puffer A (50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 100 mM NaCl) verdünnt und einer weiteren Reinigung unter Verwendung einer 5 ml HiTrap Heparin HP-Säule (Cytiva) mit Heparin-Puffer A und Heparin-Puffer unterzogen B (50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 1 M NaCl). Die Zielproteinfraktion wurde dann gesammelt und unter Verwendung der HiPrep 26/10-Entsalzungssäule mit Stammpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl) gepuffert. Diese chromatographischen Reinigungen wurden auf dem AKTA-Startsystem (Cytiva) durchgeführt. Wir haben die Standardvorlagenprogramme für Affinität, Ionenaustausch und Entsalzung für die Prozesse HisTrap, HiTrap Heparin und HiPrep Desalting verwendet.

Finalisierung und Lagerung der gereinigten Proteine. Abschließend wurde das Protein durch Ultrafiltration mit einem Amicon Ultra-4 30 K-Gerät (Millipore) konzentriert. Die Konzentration von VTopoI wurde auf 200 µM eingestellt und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert. Die molare Konzentration von VTopoI wurde durch Messung der optischen Absorption bei 280 nm und Berechnung des molaren Absorptionskoeffizienten mithilfe der CLC-Hauptwerkbank (Qiagen, Hilden, Deutschland) bestimmt. Für T4 PNK wurde die Proteinkonzentration auf 2 mg/ml eingestellt (Bradford-Methode, standardisiert mit Rinderserumalbumin), und die Lösung wurde dann mit gleichem Volumen Glycerin ergänzt und bei –20 °C gelagert. Die Aktivitäten der gereinigten VTopoI-Proteine wurden wie in den ergänzenden Methoden beschrieben getestet.

Die in dieser Studie verwendeten ODNs sind in der Ergänzungstabelle S1 zusammengefasst. Eine 1-ml-Reaktion mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 160 mM Natriumchlorid, 10 µM TOPO-Adapter-F, 10 µM TOPO-Adapter-R (TA oder stumpf) und 10 µM TOPO-Adapter-Ext wurde in einem 1,5-ml-Reagenzglas zubereitet. Die Reaktionsmischung wurde 3 Minuten lang bei 95 °C, anschließend 5 Minuten lang bei 55 °C inkubiert und bei 37 °C gehalten. Dann 1 ml der Oligomischung, 1 ml 5 × Topo-Aktivierungspuffer (100 mM Tris-Acetat, pH 8,0, 250 mM Kaliumacetat und 50 mM Magnesiumacetat), 100 µL 100 mM Adenosintriphosphat (ATP), und 100 µL 1 mg/ml T4 PNK wurden in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und das Gesamtvolumen wurde mit Wasser auf 5 ml eingestellt. Nach 60-minütiger Inkubation bei 37 °C wurde die Reaktionsmischung auf 30 °C abgekühlt und 250 µL 200 µM VTopoI zugegeben. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 30 °C inkubiert.

Das Reaktionsgemisch wurde dann auf eine 1-ml-HiTrap-Heparin-HP-Säule geladen und mit den Heparinpuffern A und B wie oben beschrieben getrennt. Die Fraktionen wurden sowohl mittels Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) als auch Agarosegelelektrophorese analysiert. Für die SDS-PAGE wurden die Proben auf einem Mini-PROTEAN Any kD-Gel (BioRad Laboratories) laufen gelassen und das Gel wurde mit Bullet CBB Stain One (Nacalai Tesque) gefärbt. Für die Agarosegelelektrophorese wurden 10 µL jeder Fraktion entnommen, mit 1 µL 10 %iger SDS-Lösung ergänzt und 1 µL der Mischung in das E-Gel Ex-Gel (2 %) geladen. Auf der Heparinsäule erschienen zwei Hauptpeaks, und die Fraktion, die den VTopoI-ODN-Komplex enthielt, eluierte früher als das nicht umgesetzte VTopoI. Die den VTopoI-ODN-Komplex enthaltende Fraktion wurde gesammelt und auf eine DNA-Konzentration von 150 ng/µL eingestellt, gemessen mit dem Qubit dsDNA HS-Kit. Bei Bedarf wurde die Lösung mit einem Amicon Ultra-4 30 K-Gerät konzentriert und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert.

Alle in der aktuellen Studie verwendeten menschlichen Seren und Plasmen wurden aus kommerziellen Quellen bezogen und sind in der Ergänzungstabelle S2 zusammengefasst. Das unten beschriebene Verfahren stellt die cfDNA-Herstellung aus 100 µL menschlichem Serum dar. Das verwendete Serum- oder Plasmavolumen war jedoch je nach Versuchszweck unterschiedlich (das anfängliche Serum-/Plasmavolumen ist in den einzelnen Daten angegeben). In solchen Fällen wurden die Mischungsverhältnisse der Reagenzien beibehalten.

In ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf) werden 100 µL Humanserum, 400 µL 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 µL 500 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1,5 µL 5 M NaCl, 10 µL … gegeben 10 % (Gew./Vol.) SDS und 10 µL 20 mg/ml Proteinase K (Qiagen) wurden zugegeben und 1 Stunde bei 50 °C inkubiert. Nach dem Proteaseverdau wurden Extraktionen zweimal mit TE Saturated Phenol (Nippon Gene) und einmal mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) (Nacalai Tesque) durchgeführt. Anschließend wurde die wässrige Phase in ein neues Röhrchen überführt und mit 50 µL 3 M Natriumacetat, pH 5,4, und 1100 µL Isopropanol ergänzt. Die Mischung wurde 5 Minuten lang bei 15.000 × g zentrifugiert und der Überstand durch Dekantieren verworfen. Anschließend wurde das DNA-Pellet mit 70 % (v/v) Ethanol gespült und in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, gelöst.

Die Bibliotheksvorbereitung aus cfDNA unter Verwendung des TACS-T4-Schemas wurde wie zuvor beschrieben10 mit einigen Modifikationen durchgeführt: Wir wiederholten die auf der reversiblen Festphasenimmobilisierung (SPRI) basierende Adapter-Dimer-Entfernung nur zweimal, während diese Entfernung in der vorherigen Studie fünfmal wiederholt wurde .

TACS-Ligation. Eine Lösung, die die Ziel-ssDNA enthielt, wurde mit 2,5 µL 10 × TACS-Puffer [500 mM 2-(4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-yl)ethansulfonsäure (HEPES)-KOH, pH 7,5, 50 mM MgCl2, 5 % (v/v) Triton X-100] und 1 µL Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) (New England Biolabs, Ipswich, MA); Das Gesamtvolumen wurde dann mit ddH2O auf 11 µL eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde 15 Minuten lang bei 37 °C und 5 Minuten lang bei 95 °C inkubiert. Als nächstes 10 µL 50 % (w/v) Polyethylenglykol (PEG) 6000, jeweils 1 µL 10 mM ATP, 25 µM Adapter für Ver. X (X steht für die Protokollversionsnummer 1–5, siehe Ergänzungstabelle S1), 1 µL 15 U/µL TdT (Takara Bio Inc, Shiga Japan) und 1 µL 2 mg/ml TS2126 RNA-Ligase wurden hinzugefügt. TS2126-RNA-Ligase wurde wie zuvor beschrieben10 hergestellt. Beachten Sie, dass die TS2126-RNA-Ligase durch die CircLigase II-ssDNA-Ligase von Lucigen (Middleton, WI) ersetzt werden kann. Die Reaktion wurde 15 Minuten lang bei 37 °C, 30 Minuten lang bei 65 °C und 5 Minuten lang bei 95 °C inkubiert.

Replikation von mit Adapter markierter ssDNA. Die mit dem Adapter markierte ssDNA-Lösung wurde mit 14 µL ddH2O, 5 µL 10 × ExTaq-Puffer (Takara Bio), 4 µL 2,5 mM dNTPs, 1 µL 50 µM Replikationsprimer (Ergänzungstabelle S1) und 1 µL gemischt 5 Einheiten/µL Heißstart GeneTaq (Nippon Gene), gefolgt von einer Inkubation bei 95 °C für 3 Minuten, 45 °C für 5 Minuten, 55 °C für 5 Minuten und 65 °C für 5 Minuten.

VOC-vermittelte Kennzeichnung des zweiten Adapters. Nach der Komplementärstrangsynthese wurden 5 µL 500 mM EDTA (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) und 1 µL 150 mg/ml VOC (TA-Typ) zum Reaktionsgemisch gegeben und 15 Minuten bei 25 °C inkubiert.

Reinigung der Bibliothek. Nach dem zweiten Adapter-Tagging wurde die Reaktionsmischung mit 35 µL Puffer B2 (3 M Guanidinhydrochlorid, 20 % Tween 20) und 5 µL Proteinase K (Qiagen) ergänzt und 15 Minuten bei 50 °C inkubiert. Dann wurden 2 µL Sera-Mag Carboxylate Magnetic Beads (Cytiva, Marlborough, MA) und 100 µL Isopropanol gemischt. Nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Magnetpartikel auf einem Magnetständer gesammelt und der Überstand entfernt. Die Perlen wurden zweimal mit 200 µL einer Lösung gewaschen, die 32 % (v/v) PEG400, 1 M NaCl und 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthielt. Abschließend wurden die Perlen mit 70 % (v/v) Ethanol gespült und die gereinigte DNA mit 25 µL 10 mM Tris-Acetat, pH 8,0, eluiert.

Behandlung mit Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) und Apurin-/Apyrimidin-Endonuklease 1 (APE 1), Nick-Füllung und PCR-Amplifikation. Zur gereinigten Bibliothek 5 µL 10 × ExTaq-Puffer, 4 µL 2,5 mM dNTPs, 1 µL 20 µM Amplification Univ (Ergänzungstabelle S1), 1 µL 20 µM Amplification Index-X (X bezieht sich auf einen der Indizes). , siehe Ergänzungstabelle S1), 1 µL UDG (New England Biolabs) und 1 µL APE 1 (New England Biolabs) wurden hinzugefügt. UDG und APE 1 wurden nur mit der TACS-TOPO-Version verwendet. 4-Protokoll (siehe Abschnitt „Ergebnisse“). Nachdem das Reaktionsvolumen mit Wasser auf 50 µL eingestellt wurde, wurde die Reaktion 15 Minuten lang bei 37 °C (wenn UDG und APE 1 enthalten waren), 5 Minuten lang bei 72 °C und 1 Minute lang bei 95 °C inkubiert, gefolgt von Zyklen von 3-stufigen Inkubationen bei 95 °C für 15 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 1 min. Die Anzahl der verwendeten Zyklen ist in den dargestellten Daten angegeben. Bei Bedarf wurde die Reaktionsmischung mit 90 µL AxyPrep MAG PCR clean (Corning, Corning, NY) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die gereinigte DNA wurde in 21 µL 10 mM Tris-Acetat, pH 8,0, eluiert.

Die in der aktuellen Studie verwendete alte menschliche DNA wurde wie zuvor beschrieben23 extrahiert. Es wurden Knochen aus der Inome-Höhle24 und der Shimekake-Stätte25 verwendet. Die in der aktuellen Studie verwendeten alten DNAs sind in der Ergänzungstabelle S3 zusammengefasst. Da die Konzentrationen der gereinigten alten DNA schwach und schwer abzuschätzen waren, führten wir Sequenzierungsbibliotheksvorbereitungen durch, ohne die Konzentrationen zu messen.

Die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek auf der Grundlage herkömmlicher, auf dsDNA ausgerichteter Methoden wurde entweder mit dem ThruPlex DNA Seq Kit (Takara Bio Inc.) oder dem KAPA Hyper Prep Kit (Kapa Biosystems, Kapstadt, Südafrika) durchgeführt.

ThruPlex DNA Seq-Kit. Ausgehend von einer angegebenen DNA-Menge wurden Endpolierung und Adapterligation gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Anschließend wurde eine 50-µL-PCR-Mischung gemäß der Anleitung des Herstellers hergestellt. Die Reaktion wurde 3 Minuten bei 72 °C, 2 Minuten bei 84 °C und 2 Minuten bei 98 °C inkubiert, gefolgt von vier Zyklen dreistufiger Inkubationen bei 98 °C für 20 Sekunden und 67 °C für 20 Sekunden und 72 °C für 40 s und acht Zyklen zweistufiger Inkubation bei 98 °C für 20 s und 72 °C für 50 s. Das Reaktionsgemisch wurde mit 50 µL AxyPrep MAG PCR ergänzt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Magnetkügelchen wurden dann mit 70 % (v/v) Ethanol gespült und die gereinigte DNA wurde in 25 µL 10 mM Tris-Acetat, pH 8,0, eluiert. Die gereinigte Bibliothek wurde bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert.

Kapa Hyper Prep Kit. Eine 50-µL-Lösung mit Proben-DNA wurde mit 7 µL End Repair & A-Tailing-Puffer und 3 µL End Repair & A-Tailing-Enzym ergänzt und nacheinander 30 Minuten bei 20 °C und 30 Minuten bei 65 °C inkubiert. Die Reaktion wurde mit 5 µL 300 nM Kapa-Universaladapter, 30 µL Ligationspuffer, 5 µL Wasser und 10 µL DNA-Ligase ergänzt und 15 Minuten bei 20 °C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion mit 88 µL AMPure XP-Perlen (Beckman) ergänzt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Perlen wurden auf einem Magnetständer gesammelt, um den Überstand zu entfernen, zweimal mit 80 % (v/v) Ethanol gespült und die gereinigte DNA wurde mit 20 µL 10 mM Tris-Acetat, pH 8,0, eluiert. Eine PCR-Reaktion wurde durch Mischen von 20 µL gereinigter DNA, 25 µL KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix (2X) und 5 µL Primer-Mix aus KAPA UDI-Primer-Mixen vorbereitet und ein Temperaturwechsel unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: a Inkubation vor der PCR bei 98 °C für 45 s; angegebene Zyklen von dreistufigen Inkubationen bei 98 °C für 15 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; und eine Post-PCR-Inkubation bei 72 °C für 1 Minute.

Die molare Konzentration der Sequenzierungsbibliothek wurde mit dem Bibliotheksquantifizierungskit von Takara Bio Inc. bestimmt. Die Sequenzierung im kleinen Maßstab wurde mit MiSeq unter Verwendung des Nano-Kits MiSeq Reagent Kit v2 (300 Zyklen) im Paired-End-Modus mit 2 × 151 Zyklen durchgeführt . Für die groß angelegte Sequenzierung wurde der Paired-End-Modus mit 2 × 151 Zyklen unter Verwendung des HiSeq X Ten von Macrogen Japan Corp. (Tokio, Japan) durchgeführt.

cfDNA-Analyse. cfDNA-Reads wurden wie zuvor beschrieben analysiert10. Nukleosomengeschützte DNA (NPD) wurde als DNA-Fragmente mit einer Länge von 147–190 nt definiert. Im Gegensatz dazu wurde zellfreie 3S-DNA (kurze einzelsträngige DNA (C3D)) als Fragmente von 35–75 nt definiert.

Antike Proben. Lesevorgänge wurden zunächst mit fastp26 vorverarbeitet, um Paired-End-Lesevorgänge zu kürzen und zu einer einzigen Sequenz zusammenzuführen. Die zusammengeführten Reads wurden dann mit dem Burrows-Wheeler Alignment Tool (BWA) mit der Option „mem“27 auf das menschliche Referenzgenom abgebildet. Abschließend wurden die exportierten Sequence Alignment/Map (SAM)-Dateien mit mapDamage28,29 analysiert. Einzelheiten zu den Analyseparametern finden Sie in den Ergänzenden Methoden.

Wir haben VTopoI künstlich synthetisiert und in drei Expressionsvektoren subkloniert. Wir verwendeten pColdTF, pColdI und pET28a für die bakterielle Expression von VTopoI und induzierten erfolgreich die Proteinexpression (Ergänzende Abbildung S1A). Anschließend wurden Nickelharzreinigungen mit der HisTrap HP-Säule durchgeführt (Ergänzende Abbildung S1A). Das Eluat aus der Nickelsäule wurde unter Verwendung von Heparinharz weiter fraktioniert (Ergänzende Abbildung S1B, C). Nach der Reinigung wurde die Proteinreinheit für alle verwendeten Vektorsysteme auf mehr als 95 % geschätzt (Ergänzende Abbildung S1D). Die Aktivitäten des gereinigten Proteins wurden hinsichtlich der Relaxation des superspiralisierten Plasmids11 untersucht. Alle gereinigten rekombinanten Proteine zeigten Aktivität (Ergänzende Abbildung S1E). Somit haben wir die aktiven VTopoI-Proteine erfolgreich gereinigt. Da die mit dem pET28a-System erhaltene Proteinausbeute gering war, verwendeten wir für die weitere Entwicklung mit pColdI und pColdTF hergestelltes VTopoI.

VTopoI erkennt spezifisch die Pentanukleotidsequenz 5′-(C/T)CCTT-3′ auf der Substrat-dsDNA und spaltet das 3′-Ende der Sequenz, um eine kovalente Bindung mit der 3′-Phosphatgruppe zu bilden13,21. Diese Einzelstrangspaltung führt zur Freisetzung von Supercoiling. Nach der Relaxation der Substrat-DNA erfolgt die Rückreaktion, um den gespaltenen Strang wieder zu verbinden. Für den Fall, dass die Substrat-DNA an der gegenüberliegenden Position der Spaltungsstelle einen Bruch oder eine Lücke aufweist, wird die stromabwärts gelegene DNA der Erkennungssequenz aus dem Zwischenkomplex freigesetzt, um einen aktivierten VTopoI-DNA-Komplex zu bilden (Abb. 1A, Reaktion 1). . Wenn ein DNA-Molekül mit einem kompatiblen Ende verfügbar ist, führt VTopoI die Rückreaktion durch, um mit dem DNA-Molekül zu ligieren21. Diese Reaktion ist schnell und effizient und bildet die Grundlage der Topo-basierten Ligation.

Bildung und Reinigung des VTopoI-Oligonukleotid-Komplexes (VOC). (A) Schema der Komplexbildung. Die Bildung von VOC ist eine Gleichgewichtsreaktion. Die Phosphorylierung der freigesetzten DNA erhöht effektiv die Menge des gebildeten Komplexes. (B,C) Ein Beispiel für die VOC-Bildung. Die Auswirkungen von T4 PNK und Pufferzusammensetzungen auf die Komplexbildung werden gezeigt. Gezeigt werden Gelbilder von SDS-PAGE (B) und Agarosegelelektrophorese mit E-Gel Ex (C). Mit pColdTF ausgedrücktes VTopoI wurde zur VOC-Bildung verwendet. Das erwartete VTopoI-Protein, das mit dem pColdTF-Vektor exprimiert wird, beträgt 91,0 kDa. (D) Reinigung der VOC mit Heparin-Säulenchromatographie. Gezeigt werden SDS-PAGE-Analysen (oben) und Chromatogrammanalysen (unten) der Fraktionen. Die blauen und roten Linien im Chromatogramm zeigen die Absorption bei 280 nm bzw. den Gehalt der Lösung B an. Die Zahlen auf dem Gelbild und dem Chromatogramm geben die Fraktionsnummern an. Die VOC wird früher eluiert als VTopoI. Die Original-Gelbilder für B, C und D sind in der ergänzenden Abbildung S5 dargestellt.

Da die Reaktion zwischen der 5′-(C/T)CCTT-3′-haltigen Substrat-DNA und VTopoI bidirektional ist, wird das Verhältnis des VTopoI-DNA-Komplexes zum freien VTopoI durch die Konzentrationen dieser Moleküle definiert (Abb. 1A). , Reaktion 1). Somit würde die Verhinderung der Rückreaktion die Bildung des kovalenten Zwischenprodukts von VTopoI und DNA effektiv steigern (Abb. 1A, Reaktion 2). Um dies zu erreichen, ist die Phosphorylierung der freigesetzten DNA nützlich, da die freigesetzte DNA nach der 5′-Phosphorylierung nicht wieder verbunden werden kann (Abb. 1A, Reaktion 2). Wie erwartet wurde die Bildung des kovalenten Zwischenprodukts von VTopoI mit ODN (VOC) verstärkt, wenn die Reaktion mit T4 PNK und ATP ergänzt wurde (Abb. 1A–C). Auch die Bestandteile der Lösung beeinflussen die Menge der gebildeten VOC. Aus unbekannten Gründen war das Acetat-Ion für die Komplexbildung wirksamer als das Chlorid-Ion (Abb. 1B, C). Wir fanden auch heraus, dass aus dem pColdI-Konstrukt hergestelltes VTopoI dazu neigt, während der VOC-Bildung auszufallen (nicht gezeigt); Daher haben wir für die weitere Entwicklung das pColdTF-basierte VTopoI verwendet. Basierend auf diesen und anderen Untersuchungen haben wir eine der effizienten Bedingungen für die VOC-Bildung ausgewählt (siehe Abschnitt „Materialien und Methoden“).

Nach der VOC-Bildung enthält die Lösung noch nicht umgesetztes ODN, VTopoI und T4 PNK, die entfernt werden sollten, um Nebenreaktionen in den nachgeschalteten Vorgängen zu verhindern. Wir fanden heraus, dass die Heparin-Affinitätschromatographie auch für diesen Zweck wirksam war (Abb. 1D). Nicht umgesetzte ODNs sind negativ geladen und können sich nicht an das negativ geladene Heparinharz binden. Das VOC kann über VTopoI an die Heparinsäule binden, wird jedoch bei niedrigeren Salzkonzentrationen eluiert als das nicht umgesetzte VTopoI und T4 PNK (Abb. 1D). Daher kann die Trennung von VOC von anderen nicht umgesetzten Materialien durch einen einzigen chromatographischen Vorgang mit einer Heparinsäule erreicht werden. Nach der Abtrennung können die VOC leicht durch Ultrafiltration konzentriert werden. Die gereinigte VOC zeigte eine einigermaßen hohe Ligationsaktivität mit einer Modell-dsDNA (siehe unten); Diese Aktivität konnte bei Lagerung bei 4 °C über einige Monate aufrechterhalten werden.

Als nächstes untersuchten wir die Spezifität und Effizienz der Adaptermarkierung durch VOC-vermittelte Ligation. Als Modellsubstrate für dieses Experiment haben wir doppelsträngige ODNs (TOPO-Substrate) vorbereitet. Die TOPO-Substrate waren so konzipiert, dass sie an einem Ende (reaktives Ende) eine VOC-vermittelte Ligation akzeptieren, während das andere Ende mit 5'-FAM und 3'-Phosphorylierung blockiert war (inaktives Ende) (Abb. 2A). Am reaktiven Ende wurden stumpfe und 3′-überstehende Enden mit A, C, G oder T präpariert, um die Stringenz der Ligation zu sehen (Abb. 2A). Um die Spezifität von VOC für die Phosphorylierungszustände des 5'-Endes zu untersuchen, haben wir außerdem sowohl 5'-Hydroxyl- als auch 5'-phosphorylierte Enden für das reaktive Ende vorbereitet (Abb. 2A). Für die VOC wurden Blunt-End- und TA-Ligationstypen vorbereitet (Abb. 2A).

Substratspezifitäten des VTopoI-Oligonukleotidkomplexes (VOC). (A) Strukturen von VOCs (links) und TOPO-Substraten (rechts). (B) Bilder der Gelelektrophorese nach dem Mischen der VOC- und TOPO-Substrate. Blunt- (rechts) und TA-VOC-Typen (links) wurden auf ihre Reaktivität mit Substraten mit oder ohne 5′-Phosphat und einem Basenvorsprung untersucht. Bei einer Ligation verschiebt sich die Bande nach oben. Die Symbole bedeuten Folgendes: o, Hydroxylende; p, phosphoryliertes Ende; A-, C-, G- oder T-terminales Nukleotid, das am 5′-Ende des Substrats angebracht ist. Für experimentelle Details siehe Ergänzende Methoden. Die Original-Gelbilder für B sind in der ergänzenden Abbildung S6 dargestellt.

Wir untersuchten die Ligationseffizienz aller Kombinationen von TOPO-Substraten und VOCs (Abb. 2B). Beide VOCs, also der Blunt- und der TA-Typ, zeigten eine starke Ligationsaktivität mit dem TOPO-Substrat der kompatiblen Enden. Die Reaktion war innerhalb von 15 Minuten nahezu abgeschlossen, wenn ausreichend VOCs zugeführt wurden (Abb. 2B und ergänzende Methoden). Obwohl die VOCs am 5′-Hydroxylende eine starke Aktivität zeigten, verbanden sie den Adapter nie mit dem 5′-phosphorylierten Ende (Abb. 2B). Die Adapterligation an das TOPO-Substrat des kompatiblen Endes schien effizient zu sein, wohingegen die Basenpaarungen nicht so stringent waren wie die Phosphorylierung am 5′-Ende; Die VOC vom TA-Typ war mit T-, C- und G-Vorsprüngen aktiv, während der stumpfe Typ mit allen Vorsprüngen reagierte (Abb. 2B). Obwohl die Stringenz der Ligation durch Zugabe von Natriumchlorid30 erhöht werden kann, wurde eine erhöhte Stringenz unter dem Risiko eines schwerwiegenden Verlusts der Ligationseffizienz erreicht (nicht gezeigt). Die Spezifität der VOCs für die nichtphosphorylierten Substrate schien ideal für die zweite Adaptermarkierung nach der TACS-Ligation zu sein (siehe Einleitung). Aus diesem Grund haben wir mit der Entwicklung eines neuen Bibliotheksvorbereitungsprotokolls begonnen.

Da VOC eine effiziente Adaptermarkierung der 5′-unphosphorylierten dsDNA zeigte und nicht mit 5′-phosphorylierter DNA reagierte (Abb. 2B), gingen wir davon aus, dass VOC eine effiziente zweite Adaptermarkierung ohne Adapterdimerbildung realisieren könnte. Bei Verwendung von 83 ng (5 pmol) zufälligem 50-mer (N50) als Modellziel war die Ausbeute der Bibliothek mit zwei angehängten Adaptersequenzen mit dem TACS-T4-Schema gering (Abb. 3A, Spur 4, grüner Stern). . Im Gegenteil wurde mit dem TACS-TOPO-Schema eine drastisch verbesserte Bibliotheksausbeute beobachtet (Abb. 3B, Spur 4, grüner Stern). Darüber hinaus enthielten die mit TACS-T4 hergestellten PCR-amplifizierten Bibliotheken eine große Menge an Adapterdimeren, während mit dem TACS-TOPO-Schema nur eine Insert-positive Bibliothek beobachtet wurde (Abb. 3C). Diese Ergebnisse zeigten, dass das TACS-TOPO-Schema dem TACS-T4-Schema hinsichtlich hoher Bibliotheksausbeuten und geringer Bildung von Adapterdimeren überlegen ist.

Vergleich von Bibliotheksvorbereitungsschemata aus einzelsträngiger DNA. (A,B) TACS-T4 (A) und TACS-TOPO (B). Dargestellt sind das Schema (links) und die Analyse der DNA bei jedem Reaktionsschritt mit denaturierender Gelelektrophorese (rechts). Die Zahlen in Kursivschrift geben die Länge der verwendeten DNA an. Die farbigen Sterne im linken Schema entsprechen den Bändern in den rechten Gelbildern. Die Spuren sind wie folgt gekennzeichnet: (1) vor der TACS-Ligation; (2) nach TACS-Ligation; (3) nach komplementärer Strangsynthese mit Taq-DNA-Polymerase; (4) nach dem zweiten Adapter-Tagging; und (5) nach SPRI-Reinigung. (C) Ein Gelbild, das die Analyse PCR-amplifizierter Bibliotheken zeigt. DNA-Fragmente, die aus Bibliotheken amplifiziert wurden, die mit TACS-T4 (Spuren 1 und 2: technische Duplikate) und TACS-TOPO (Spuren 3 und 4: technische Duplikate) erstellt wurden, wurden auf ein denaturierendes Gel geladen. Für beide Bibliotheken wurden 20 Zyklen PCR-Amplifikationen durchgeführt. Adapterdimere waren nur in den mit TACS-T4 hergestellten Bibliotheken erkennbar. Die Original-Gelbilder finden Sie in der ergänzenden Abbildung S7.

Als nächstes untersuchten wir die Empfindlichkeit der Adapter-Dimer-freien Bibliotheksvorbereitung mithilfe des TACS-TOPO-Schemas. In diesem Experiment verwendeten wir erneut N50 als Modell und untersuchten das Auftreten von Adapterdimeren (Version 1, Abb. 4A, B und ergänzende Abbildung S2A). Wie in Abb. 4C gezeigt, wurden nicht vernachlässigbare Mengen an Adapterdimeren beobachtet, wenn die zugeführte DNA auf weniger als 24 ng reduziert wurde. Die Unvollkommenheit der 5′-Phosphorylierung des bei der TACS-Ligation verwendeten Adapters könnte dieses Phänomen erklären, da wir bei Verwendung eines Adapter-Oligonukleotids mit einem höheren Reinigungsgrad eine verringerte Bildung des Adapter-Dimers beobachteten (Version 2, Abb. 4B und ergänzende Abbildungen S2A und S2C). ). Da jedoch eine weitere Reinigung des Adapters die Dimerbildung nicht verbessern konnte (nicht gezeigt), mussten wir andere experimentelle Prinzipien kombinieren, um die Adapterdimere zu reduzieren. Die erste bestand darin, einen kürzeren Adapter zu verwenden, um die Dimere effizienter zu entfernen (Version 3, Abb. 4B, ergänzende Abbildungen S2A und S2D). Die andere Möglichkeit bestand darin, einen Uracilrest in der Nähe der 5′-Seite des für die TACS-Ligation verwendeten Adapters hinzuzufügen, um das Dimer abzubauen, bevor die Bibliothek durch PCR amplifiziert wurde (Version 4, Abb. 4B, D und ergänzende Abbildung S2A, E). In Kombination mit dem TACS-TOPO-Schema führten diese beiden Ansätze zu dimerfreien Bibliothekspräparationen aus 24 pg N50 (Abb. 4E und ergänzende Abbildung S2E, G), was der DNA-Menge aus vier menschlichen Zellen entspricht. Daher ist die Herstellung einer Adapter-Dimer-freien Bibliothek aus kleinen Mengen ssDNA mit TACS-TOPO Version praktisch geworden. 4.

Verbesserungen am TACS-TOPO-Schema. (A) Das TACS-TOPO-Schema. (B) Verbesserungen, die auf verschiedene Versionen des Protokolls angewendet wurden. OPC: Oligonukleotid-Reinigungskartuschenqualität, HPLC: Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Reinigungsqualität. (C) Die erste Version (Version 1) produzierte mehrere Adapterdimere. (D) Das in der Version eingeführte Adapter-Dimer-Abbauschema. 4 Protokoll. Der Uracil-Rest im Adapter wird vor der PCR-Amplifikation der Bibliothek mit UDG und APE 1 abgebaut. Diese Behandlung führt zum Abbau des Adapterdimers. (E) Bibliotheksvorbereitung mit TACS-TOPO ver. 4 Protokoll. Die Empfindlichkeit der Dimer-freien Bibliotheksvorbereitung wurde verbessert, um hochempfindliche Bibliotheksvorbereitungen aus ssDNA zu realisieren. Die Original-Gelbilder für C und E sind in der ergänzenden Abbildung S8 dargestellt.

Zuvor haben wir eine Reihe von 50 Nukleotiden langen, einzelsträngigen cfDNAs in der zellfreien Fraktion des menschlichen peripheren Blutes identifiziert und sie C3D10 genannt. Wir haben das TACS-T4-Schema zur Analyse von cfDNA angewendet und festgestellt, dass C3D eine neue Klasse von cfDNA umfasst. Die dominierte Amplifikation des Adapterdimers mithilfe des TACS-T4-Schemas erforderte jedoch eine arbeitsintensive Entfernung des Dimermoleküls durch Wiederholung der SPRI-Reinigungsschritte10. Da das optimierte TACS-TOPO-Schema für die Dimer-freie Bibliotheksvorbereitung aus einer begrenzten Menge an ssDNA wirksam ist (Abb. 4E), haben wir TACS-TOPO Version angewendet. 4 zur Bibliotheksvorbereitung aus cfDNA. Für diese Analyse verwendeten wir als Modell ein gepooltes Humanserum, das aus einer kommerziellen Quelle bezogen wurde (Ergänzungstabelle S2, Eintrag Nr. 1). Wie in Abb. 5A gezeigt, wurden Sequenzierungsbibliotheken ohne Adapterdimerbildung unter Verwendung von TACS-TOPO Version erstellt. 4.

Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek aus cfDNA. (A) Vergleich von Bibliotheken, die mit TACS-T4 und TACS-TOPO erstellt wurden. (B) Bibliothekserträge von TACS-TOPO ver. Dargestellt sind 4 aus verschiedenen Serumvolumina. Die durch horizontale Linien getrennten Zonen geben die Stärke der Verstärkung an, die für die Sequenzierung erforderlich ist, um 90-GB-Lesevorgänge zu erhalten. (C) Gelbild, das die Analyse amplifizierter cfDNA-Bibliotheken zeigt, die mit TACS-TOPO Ver. erstellt wurden. 4. Nach der denaturierenden Gelelektrophorese auf einem 6 %igen Gel wurde das mit SYBR-Gold gefärbte Gel fotografiert. (D) Größenverteilung der Lesevorgänge, die dem menschlichen Referenzgenom zugeordnet sind. Eine aus 50 µL Serum mit TACS-TOPO Ver. hergestellte Bibliothek. 4 wurde sequenziert und dem menschlichen Referenzgenom zugeordnet. (E) Kolokalisierung kartierter Lesevorgänge auf G4-seq-Peaks und G4-Motiven. Aus den kartierten Lesevorgängen wurden Fragmente von 35–75 nt ausgewählt und auf ihre Kolokalisierung mit den G4-seq-Peaks und G4-Motiven analysiert. Für (A – E) wurde das gleiche Serum (Nr. 1 in der Ergänzungstabelle S2) verwendet. (F–H) Sequenzierungsbibliotheken, die aus 50 µL Serum oder Plasma aus verschiedenen Quellen hergestellt wurden, werden angezeigt (Ergänzungstabelle S2). Die Bibliotheksausbeuten (F) und Gelelektrophoresebilder der amplifizierten Bibliotheken werden für das ThruPlex DNA Seq Kit (G) und TACS-TOPO Version angezeigt. 4 (H). Die 6 % TBE-Harnstoff am unteren Rand des Gelbildes weisen auf eine Analyse mit denaturierender Gelelektrophorese unter Verwendung von 6 % Novex TBE-Harnstoffgel (Thermofisher Scientific) hin, und 2 % E-Gel Ex weist auf eine Analyse mit E-Gel Ex (2) hin %) (Thermofisher Scientific). Die Original-Gelbilder für A, C, G und H sind in der ergänzenden Abbildung S9 dargestellt.

Im Gegensatz dazu wurde bei TACS-T4 eine hohe Rate der Bildung von Adapterdimeren beobachtet, selbst nach Durchführung einer SPRI-basierten Reinigung zur Dimerentfernung (Abb. 5A). Das Auftreten von zwei zuvor identifizierten Hauptpeaks, die nukleosomengroßer cfDNA (nukleosomengeschützter DNA oder NPD; etwa 160 nt lange Inserts) und C3D in den PCR-amplifizierten Bibliotheken entsprechen, unterstützte die Machbarkeit von TACS-TOPO Version. 4 für die cfDNA-Analyse (Abb. 5A). Wir fanden heraus, dass aus 50 µL Serum extrahierte cfDNA für die amplifikationsfreie Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung ausreichte und dass Sequenzierungsbibliotheken mit drei PCR-Zyklen erfolgreich aus 6,25 µL Serum hergestellt werden konnten (achtfache Amplifikation, Abb. 5B, C). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TACS-TOPO die Empfindlichkeit der cfDNA-Analyse erheblich steigerte, da für TACS-T4 mindestens 250 µL Plasma oder Serum und 10 PCR-Amplifikationszyklen erforderlich waren10. Wir haben die aus 50 µL menschlichem Serum hergestellte TACS-TOPO-Bibliothek sequenziert, um zwei Hauptpeaks in der Größenverteilung der kartierten Leseausrichtungen zu finden (Abb. 5D).

C3D wurde als cfDNA-Fragmente mit einer Länge von 35–75 nt definiert. Es ist bekannt, dass die kartierten Lesevorgänge von C3D scharfe Peaks bilden, ein repräsentatives Merkmal von C3D (Ergänzende Abbildung S3)10. Die C3D-Peaks kolokalisieren mit mehreren genomischen Merkmalen, und die Antisense-Strukturen von G-Quadruplex (G4) kolokalisieren am besten mit den C3D-Peaks10. Daher haben wir untersucht, ob die C3D-Peaks mit den mit der TACS-TOPO-Version erhaltenen Lesevorgängen aufgerufen werden. 4 kolokalisierte mit den G4-Strukturen. Die C3D-Peaks waren gut mit den Antisense-Strängen von G4-Motiven und Peaks von G4-seq kolokalisiert (Abb. 5E und ergänzende Abbildung S3). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TACS-TOPO die bisher bekannten Merkmale in der cfDNA-Analyse erfassen kann.

Um die Unterschiede zwischen TACS-TOPO Version zu vergleichen. 4 Mit einem herkömmlichen dsDNA-adaptierten Bibliotheksvorbereitungsprotokoll untersuchten wir die Ausbeuten und Größenverteilung der Sequenzierungsbibliotheken, die aus der aus Plasmen und Seren gesunder Personen extrahierten Blut-cfDNA hergestellt wurden (Einzelheiten siehe Ergänzungstabelle S2). Für diesen Vergleich haben wir uns für das ThruPlex DNA seq Kit von Takara Bio entschieden, da es sich um ein Standardkit mit hervorragenden Bibliotheksausbeuten handelt. Wie in Abb. 5F gezeigt, ist die TACS-TOPO-Version. 4 zeigte durchweg bessere Bibliothekserträge als das ThruPlex-Kit. Ein deutlicher Unterschied zwischen den beiden Protokollen wurde hinsichtlich der Größenverteilung der amplifizierten Bibliothek beobachtet; Mit dem ThruPlex-Kit wurde nur ein Hauptpeak beobachtet (Abb. 5G), während mit der TACS-TOPO-Version zwei Peaks erkennbar waren. 4-Protokoll (Abb. 5H). Da die molare Konzentration von C3D im Blut mit der von NPD10 vergleichbar ist, wird erwartet, dass das an ssDNA angepasste Protokoll zur Bibliotheksvorbereitung eine höhere Bibliotheksausbeute liefert als die herkömmlichen dsDNA-spezifischen Protokolle. In Anbetracht der hohen Effizienz sind daher die höheren Bibliotheksausbeuten, die mit TACS-TOPO ver. beobachtet wurden. 4 im Vergleich zu denen, die bei ThruPlex beobachtet wurden, sind durchaus angemessen.

Aufgrund eines fortgeschrittenen Abbauzustands ist die meiste aus antiken Proben extrahierte DNA fragmentiert und einzelsträngig. Daher sollten Methoden zur Bibliotheksvorbereitung für solche Proben an ssDNA angepasst werden. Dementsprechend wurde die Nützlichkeit der ssDNA-adaptierten Bibliotheksvorbereitung für alte DNA von Meyer et al.5 und Gansauge et al.6,7 demonstriert. Darüber hinaus haben wir zuvor gezeigt, dass das TACS-T4-Schema bei Anwendung auf die cfDNA-Bibliotheksvorbereitung10 die Bibliotheksausbeuten im Vergleich zu den von Gansauge et al.6,7 etablierten Methoden erheblich verbesserte. Darüber hinaus schnitt das TACS-TOPO-Schema bei der Vorbereitung der cfDNA-Bibliothek besser ab als das TACS-T4-Schema (Abb. 5A). Daher sollte das TACS-TOPO-Schema besser für die Bibliotheksvorbereitung aus alten Proben geeignet sein, und daher führten wir anschließend eine Analyse alter DNA mit dem TACS-TOPO-Schema durch.

Als Modellproben wählten wir DNA, die aus menschlichen Knochen gewonnen wurde, die in der Inome-Höhle (Inome, Ergänzungstabelle S3)24 und der Shimekake-Stätte (Shime und Shime-t, Ergänzungstabelle S3)25 ausgegraben wurden. Da diese Stätten aus der Tumulus- bzw. späten Jomon-Ära stammen und diese Knochen von Personen stammten, die vor 1000–3000 Jahren lebten (Ergänzungstabelle S3)31,32,33, wurde erwartet, dass die extrahierten DNAs stark abgebaut und beschädigt waren. Zusätzlich zum Abbau enthält alte DNA große Mengen an desaminierten Cytosinresten oder Uracil. Da das ThruPlex-Kit für Uracil-haltige alte DNA ungeeignet ist, haben wir das KAPA Hyper Prep Kit in Kombination mit KAPA HiFi HotStart Uracil Ready Mix als nur für dsDNA angepasstes Kontrollprotokoll verwendet.

Wie erwartet waren die Ausbeuten der Bibliotheken mit der TACS-TOPO-Version 5,4–10,7-mal höher. 4 als mit dem KAPA Hyper Prep Kit (Abb. 6A). Der Bibliothekseinschub war mit TACS-TOPO Version kleiner. 4 (zwei Peaks bei 50 nt und 400 nt) als mit dem KAPA Hyper Prep-Kit (ein Peak bei mehr als 200 bp) (Abb. 6B), und die mittels Sequenzierung im kleinen Maßstab ermittelten mittleren Insertgrößen spiegelten die Verteilungsmuster von wider die Bibliotheken (Abb. 6C). Die Kartierungsraten zum menschlichen Referenzgenom waren zwischen den TACS-TOPO-Versionen nahezu gleich. 4 und KAPA Hyper Prep-Kits (Abb. 6D). Diese Ergebnisse bestätigten den hohen Grad des Abbaus alter DNAs in kurze ssDNA und die Überlegenheit des an ssDNA angepassten Bibliotheksvorbereitungsprotokolls für die Analyse solcher Proben.

Vergleich der Bibliotheksvorbereitung aus alter DNA mit TACS-TOPO und einem herkömmlichen Protokoll, das nur für dsDNA angepasst ist (KAPA Hyper Prep Kit). (A–D) Vergleiche der Bibliotheksausbeuten nach 12 Zyklen der PCR-Amplifikation (A), der Gelelektrophorese der amplifizierten Sequenzbibliotheken (B), der mittleren Alignment-Länge der sequenzierten Reads (C) und der mittleren Mapping-Raten der Reads auf der menschlichen Referenz Genom (D) werden angezeigt. Das KAPA Hyper Prep Kit wurde aufgrund seiner überlegenen Empfindlichkeit gegenüber kommerziellen Bibliotheksvorbereitungskits und seiner Toleranz gegenüber Uracil-haltiger DNA als repräsentatives Protokoll ausgewählt. E und F. Mutationsmuster wurden mit mapDamage28,29 für Bibliotheken gezeichnet, die mit dem KAPA Hyper Prep Kit (E) und TACS-TOPO Version erstellt wurden. 5 (F). Die vier oberen Diagramme für jede Bibliothek zeigen die Basisfrequenz außerhalb und innerhalb des Lesevorgangs. Das offene graue Kästchen in den Diagrammen entspricht dem Messwert. Die unteren Diagramme sind die Basensubstitutionshäufigkeiten an relativen Positionen vom 5′-Ende (links) und 3′-Ende (rechts) der Lesevorgänge. Dargestellt sind die Häufigkeiten von C bis T (rot), G bis A (blau), allen anderen Substitutionen (grau) und Soft-Clipped-Basen (orange). Kapa: KAPA Hyper Prep Kit; TT-Version. 5: TACS-TOPO ver. 5. Die Original-Gelbilder für B sind in der ergänzenden Abbildung S10 dargestellt.

In alter DNA nehmen die Desaminierungsereignisse zu den Enden der DNA-Moleküle hin zu, sodass die Häufigkeit der C-zu-T-Umwandlungen in sequenzierten Lesevorgängen tendenziell an den Enden der DNA zunimmt. Diese Änderung der Konvertierungshäufigkeit ist ein häufig verwendeter Indikator für alte DNA und wird mit dem KAPA Hyper Prep-Kit deutlich beobachtet (Abb. 6E und ergänzende Abbildung S4A, D, G). Im Gegensatz dazu ist bei TACS-TOPO ver. 4-Protokoll beobachteten wir solche Mutationsmuster nur auf der 5′-Seite der Lesevorgänge (Ergänzende Abbildung S4B, E, H). Wir haben festgestellt, dass die Uracil-DNA-Glycosidase-Behandlung zum Abbau von Adapterdimeren in der TACS-TOPO-Version führt. 4-Protokoll verursachte das Verschwinden der von C zu T konvertierten Lesevorgänge am 3′-Ende. Daher untersuchten wir alternative Modifikationen, die den Uracilrest für die Entfernung des Adapterdimers ersetzen könnten. Wir haben herausgefunden, dass der AP-Standortanalog dSpacer (dSp) für diesen Zweck verwendet werden könnte. Da bekannt ist, dass dSp durch APE 1 geschnitten wird, haben wir vor der PCR-Amplifikation zunächst APE 1 verwendet. Aus unbekannten Gründen ist APE 1 jedoch nicht erforderlich, um die Bildung des Adapterdimers zu unterdrücken (nicht gezeigt). Wir haben dieses dSp-basierte Protokoll als TACS-TOPO Version definiert. 5 (Ergänzende Abbildung S2A,F,G) und wendete es an, um die alte DNA erneut zu analysieren.

Mit der TACS-TOPO Version. 5, ähnliche Verbesserungen wie bei der TACS-TOPO-Version. 4 wurden hinsichtlich der Bibliotheksausbeuten (Abb. 6A), der Insertgrößen (Abb. 6B, C) und der Kartierungsraten (Abb. 6D) beobachtet. Im Gegenteil, die Basensubstitutionsmuster der Lesevorgänge, die mit der TACS-TOPO-Version erhalten wurden. 5 unterschieden sich von denen der TACS-TOPO-Version. 4 (Ergänzende Abbildung S4B,E,H). Näher an den Enden der Lesevorgänge wurden mit der TACS-TOPO-Version höhere Mutationsraten an beiden Enden der Lesevorgänge beobachtet. 5 (Abb. 6F, ergänzende Abbildung S4C,F,I). Interessanterweise wurden entgegengesetzte Mutationsmuster zwischen der TACS-TOPO-Version beobachtet. 5 und das KAPA Hyper Prep Kit. Mit der TACS-TOPO Version. 5, C-zu-T-Mutationen nahmen an beiden Enden der Lesevorgänge zu (Abb. 6F, ergänzende Abbildung S4C, F, I). Mit dem KAPA Hyper Prep Kit nahmen die C-zu-T-Mutationen jedoch nur am 5'-Terminus der Fragmente zu, wohingegen G-zu-A-Mutationen am 3'-Terminus der Fragmente beobachtet wurden (Abb. 6E, ergänzende Abbildung S4A, D, G). Dies ist ein typischer Unterschied zwischen an ssDNA angepassten Protokollen und Protokollen, die nur für dsDNA5 angepasst sind.

In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Verwendung von VTopoI für die Markierung des zweiten Adapters nach der TACS-Ligation, um ein effizientes und dimerfreies Verfahren zur Bibliotheksvorbereitung aus kurzer ssDNA zu etablieren. Während die VOC spezifisch für das nichtphosphorylierte 5′-Ende der DNA ist (Abb. 2) und die Verwendung der VOC die Bildung von Adapterdimeren wirksam unterdrückt, wurde das Dimer immer noch beobachtet, als die Probenmenge begrenzt war (Abb. 4C). Daher kombinierten wir einen Uracil-haltigen Adapter und eine UDG-Behandlung zur Dimerentfernung. Die resultierende TACS-TOPO-Version. 4 war wirksam für die Adaptor-Dimer-freie Bibliotheksvorbereitung aus begrenztem Probeneinsatz (Abb. 4D) und wurde erfolgreich auf die Bibliotheksvorbereitung aus cfDNA aus menschlichem Blut angewendet (Abb. 5). Da das TACS-TOPO kurze ssDNA, die in der zellfreien Blutfraktion vorhanden ist, effizient in Sequenzierungsbibliotheken umwandeln konnte, wiesen die aus Blut-cfDNA hergestellten Bibliotheken andere Zusammensetzungen auf als diejenigen, die mit herkömmlichen Protokollen erstellt wurden, die nur für dsDNA angepasst waren (Abb. 5F–H). ). Wir haben auch gezeigt, dass TACS-TOPO die Ausbeuten der Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung aus alter DNA erheblich verbessern kann (Abb. 6A). Diese erfolgreichen Beispiele untermauern die praktische Anwendbarkeit des TACS-TOPO-Schemas.

Die Verwendung der VOC für die zweite Adaptermarkierung führte zu einer verbesserten Adaptermarkierung und einer verringerten Bildung von Adapterdimeren (Abb. 3), und der Einsatz von VOC kann zusätzliche praktische Vorteile bringen. Der erste ist seine Reaktionsgeschwindigkeit; Nur 15 Minuten reichten aus, um die zweite Adaptermarkierung bei Raumtemperatur abzuschließen (Abb. 3 und ergänzende Methoden). Die auf VTopoI basierende Klonierungsreaktion ist schnell und kann in weniger als 5 Minuten abgeschlossen werden21; Daher kann das TACS-TOPO-Schema durch weitere Optimierung verkürzt werden. Ein weiterer Vorteil von VOC ist seine einfache Bedienung. Da für VOC keine zusätzlichen Materialien erforderlich sind, reicht es aus, der Reaktion nur VOC zuzusetzen, um die Reaktion zu starten. Daher erreicht VOC eine kurze Reaktionszeit und eine einfache Bedienung sowie hervorragende Bibliotheksausbeuten und eine reduzierte Bildung von Adapterdimeren. Diese Vorteile würden die praktische Anwendbarkeit der Sequenzbibliotheksvorbereitung aus ssDNA erheblich verbessern.

Obwohl die Verwendung von VOC für die Markierung des zweiten Adapters im TACS-TOPO-Schema die Bildung von Adapterdimeren effektiv reduziert (Abb. 3C), wurde die Bildung von Adapterdimeren immer noch mit verringerter Input-DNA nachgewiesen (Abb. 4B). Diese Beobachtung scheint paradox, da VOC nicht mit einem 5′-phosphorylierten Adapter reagieren würde (Abb. 2B). Wir glauben, dass die Kontamination des 5′-phosphorylierten Adapters mit 5′-nichtphosphoryliertem Oligonukleotid dieses Phänomen verursacht hat, da bei einem höheren Reinigungsgrad eine geringere Bildung von Adapterdimeren beobachtet wurde. In der aktuellen Studie wurde die 5′-Phosphorylierung des Adapters chemisch angebunden. Da die chemische Reaktion und die Produktreinigung schwer zu perfektionieren sind, ist eine Kontamination nicht phosphorylierter DNA im 5′-phosphorylierten Adapter unvermeidbar. Wenn diese Erklärung wahr ist, wird eine konstante Produktion von Adapterdimeren erwartet, wenn eine feste Menge an Adapter für die erste Adaptermarkierung von ssDNA verwendet wird.

Die Reduzierung und der Abbau des Adapterdimers sind die beiden möglichen Lösungen für dieses Manko. Die TACS-TOPO-Version. 4, das das Adapterdimer mit UDG abbaut, die Amplifikation des Adapterdimers stark unterdrückte und eine hochempfindliche dimerfreie Bibliotheksvorbereitung aus ssDNA realisierte (Abb. 4C, D). Allerdings ist die Anwendung des UDG-basierten Abbaus bei Uracil-haltigen Proben manchmal schwierig; Daher ist die TACS-TOPO-Version. 4 konnte nicht als allgemeines Verfahren zur Sequenzierung der Bibliotheksvorbereitung aus ssDNA verwendet werden. Im Gegensatz dazu ist TACS-TOPO ver. 5, das ein dSp im bei der TACS-Ligation verwendeten Adapter enthält, ist nützlich für eine reduzierte Adapter-Dimerbildung. Die TACS-TOPO-Version. 5 könnte für jede ssDNA verwendet werden, ist jedoch weniger empfindlich als die TACS-TOPO-Version. 4 zur Dimer-freien Bibliotheksvorbereitung (Ergänzende Abbildung S2). Daher sind weitere Studien erforderlich, um ein allgemeines und empfindliches Verfahren zur dimerfreien Bibliotheksvorbereitung aus ssDNA zu etablieren.

In der aktuellen Studie konzentrierten wir uns auf die Bibliotheksvorbereitung aus ssDNA, insbesondere aus kurzen Strängen in der zellfreien Fraktion des Blutes und aus alter DNA. Da die Ziel-DNA zu kurz ist, um über ein größenabhängiges DNA-Reinigungsverfahren vom Adapterdimer getrennt zu werden, benötigten wir andere Prinzipien, wie z. B. dU- und dSp-basierte Adapterdimerentfernung (d. h. Protokolle Version 4 und Version 5). . Wenn die ssDNA jedoch lang genug ist, um durch Größenfraktionierung vom Adapterdimer getrennt zu werden, ist die Ver. 3 Protokoll kann verwendet werden. Wie in „Materialien und Methoden“ beschrieben, wurden die Magnetkügelchen nach der Immobilisierung der mit dem Adapter markierten Ziel-DNA auf den SPRI-Kügelchen mit einer Lösung mit 32 % PEG400 gewaschen, um die nicht umgesetzten Adaptermoleküle zu entfernen. Diese Bedingung war wirksam bei der Entfernung des nicht umgesetzten Adapters und Primers, jedoch nicht des Adapterdimers. Tatsächlich könnten wir eine Sequenzierungsbibliothek aus großer Ziel-ssDNA erstellen, ohne Uracil oder dSp-haltige Adapter zu verwenden und gleichzeitig strenge Größenfraktionierungsbedingungen durchzusetzen (nicht gezeigt). Daher kann das TACS-TOPO-Schema mit entsprechenden Optionen zur Sequenzierung der Bibliotheksvorbereitung aus ssDNA verwendet werden; Nicht nur für kurze Stränge, sondern auch für längere.

Alle in dieser Studie erhaltenen Sequenzdaten wurden bei NCBI GEO und NCBI SRA unter den Zugangsnummern GSE222918 bzw. PRJNA921947 hinterlegt.

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Wir danken Mai Takigami für die Kalibrierung des Alters der in dieser Studie verwendeten alten Knochen. Wir möchten auch Editage (www.editage.com) für die Bearbeitung in englischer Sprache danken.

Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Forschungsunterstützungsprojekt für Biowissenschaften und Arzneimittelforschung (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) [JP22ama121022j0001 an FM] und von unterstützt KAKENHI von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) [JP21H00345 an FM].

Abteilung für Biochemie, Kyushu University Graduate School of Medical Sciences, 3-1-1 Maidashi, Higashi-Ku, Fukuoka, 812-8582, Japan

Fumihito Miura, Osamu Hisano, Miki Miura, Yukiko Shibata und Takashi Ito

Abteilung für Anthropologie, Nationalmuseum für Natur und Wissenschaft, 4-1-1 Amakubo, Tsukuba, Ibaraki, 305-0005, Japan

Hideaki Kanzawa-Kiriyama

Abteilung für klinische Radiologie, Kyushu University Graduate School of Medical Sciences, 3-1-1 Maidashi, Higashi-Ku, Fukuoka, 812-8582, Japan

Osamu Hisano

Abteilung für Rechtsmedizin, Interdisziplinäre Graduiertenschule für Medizin und Ingenieurwesen, Universität Yamanashi, 1110 Shimokato, Chuo, Yamanashi, 409-3898, Japan

Noboru Adachi & Tsuneo Kakuda

Nationalmuseum für Natur und Wissenschaft, 4-1-1 Amakubo, Tsukuba, Ibaraki, 305-0005, Japan

Ken-ichi Shinoda

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FM konzipierte die Studie, führte Experimente durch, analysierte Daten und verfasste die Arbeit. HK und OH analysierten Sequenzdaten. MM und YS führten Experimente durch. HK, NA, TK und KS trugen zur alten DNA bei. HK, OH und TI lasen das Manuskript kritisch. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Fumihito Miura.

FM ist Erfinder eines für TACS-TOPO angemeldeten Patents und bestätigt, dass das Patent Forschungsanwendungen der Methode nicht einschränkt. Die übrigen Autoren haben keine Interessenkonflikte zu melden.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Miura, F., Kanzawa-Kiriyama, H., Hisano, O. et al. Ein hocheffizientes Schema zur Bibliotheksvorbereitung aus einzelsträngiger DNA. Sci Rep 13, 13913 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40890-3

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Eingegangen: 20. Februar 2023

Angenommen: 17. August 2023

Veröffentlicht: 25. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40890-3

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