Bioprospektion für industriell relevante Exopolysaccharide

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 13561 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Cyanobakterielle Exopolysaccharide (EPS) sind potenzielle Kandidaten für die Herstellung nachhaltiger Biopolymere. Obwohl die bioaktiven und physikalisch-chemischen Eigenschaften von EPS auf Cyanobakterienbasis attraktiv sind, wird ihre kommerzielle Nutzung durch die hohen Produktionskosten begrenzt. Die Bioprospektion und Charakterisierung neuartiger EPS-produzierender Stämme für industriell relevante Bedingungen ist der Schlüssel zur Erleichterung ihrer Implementierung in verschiedenen biotechnologischen Anwendungen und Bereichen. In der vorliegenden Arbeit haben wir 25 portugiesische Cyanobakterienstämme aus einem vielfältigen taxonomischen Bereich (einschließlich einiger erstmals untersuchter Gattungen) ausgewählt, um sie bei Licht und Temperatur zu züchten, die portugiesischen Klimabedingungen zu simulieren, und ihre Wachstumsleistung und ihr Wachstum zu bewerten Zusammensetzung der Makronährstoffe. Die Gattungen Synechocystis und Cyanobium, die aus Meer- und Süßwasser stammen, wurden als schnell wachsend (0,1–0,2 g pro Tag pro Tag) mit unterschiedlicher Biomassezusammensetzung hervorgehoben. Synechocystis sp. LEGE 07367 und Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 zeigten eine Produktion von 0,3 und 0,4 g L−1 freigesetzter Polysaccharide (RPS). Es stellte sich heraus, dass es sich dabei um Glucan-basierte Polymere mit hohem Molekulargewicht und einer geringeren Anzahl an Monosacchariden handelte, als normalerweise für Cyanobakterien-EPS angegeben wird. Darüber hinaus wurde auch das Fehlen bekannter Cyanotoxine bei diesen beiden RPS-Produzenten bestätigt. Diese Arbeit liefert die ersten Schritte für die Entwicklung cyanobakterieller EPS-Bioprozesse unter dem portugiesischen Klima.

Cyanobakterien und Mikroalgen leisten einen wichtigen Beitrag zur Bioökonomie, indem sie Rohstoffe für Lebensmittel, Futtermittel, Bioenergie, Kosmetika und Biokunststoffe beschaffen1. Darüber hinaus wird durch erhebliche Forschungs- und Entwicklungsanstrengungen die derzeitige industrielle Produktion dieser photoautotrophen Fabriken in wirtschaftlich sinnvolle Anwendungen umgewandelt2. Bestimmte Produkte wie Biopolymere (dh Polymerstoffe natürlichen Ursprungs) sind bei der Betrachtung für Massenmärkte immer noch durch die Produktionskosten und die Kapazität begrenzt. Es gibt jedoch Märkte mit hoher Wertschöpfung für bestimmte Anwendungen, in denen Cyanobakterien/Mikroalgen-Biopolymere aufgrund ihrer spezifischen physikalisch-chemischen und/oder bioaktiven Eigenschaften erfolgreich kommerzialisiert werden können3,4,5. Die Bedeutung dieser Biopolymere für die Bioökonomie kann durch technologische Verbesserungen und die Entdeckung neuer photoautotropher Fabriken1 hervorgehoben werden. Daher ist die Bioprospektion für industriell relevante Bedingungen (z. B. Licht, Temperatur) von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von Bioprozessen und die Kostensenkung6,7.

Cyanobakterien sind eine vielversprechende Quelle für Biopolymere in Form von Polysacchariden, die intrazellulär (z. B. Glykogen) oder extrazellulär als Exopolysaccharide (EPS)8,9,10 vorkommen. EPS sind polysaccharidreiche Exsudate, die an der Außenseite der Zellwand haften. Sie liegen jedoch auch im Überstand vor und sind nicht mit der Zellwand verbunden. Obwohl der Ursprung dieser Polysaccharide im Überstand nicht vollständig geklärt ist, deuten Hinweise darauf hin, dass sie eine ähnliche Monosaccharidzusammensetzung haben11,12,13,14. Allerdings werden diese beiden Phasen unterschiedlich extrahiert und in zellgebundene Polysaccharide (CPS) und freigesetzte Polysaccharide (RPS) unterschieden15.

Diese Biopolymere wurden intensiv untersucht und einige zeigten interessante technofunktionale Eigenschaften16,17,18; mit bioaktiven Eigenschaften wie antiviralen, entzündungshemmenden und wundheilenden Eigenschaften19,20,21, was sie zu guten Kandidaten für Produkte mit hohem Mehrwert macht.

Eine umfassende Überprüfung der Methoden zur Bioprospektion von Cyanobakterien-EPS zeigte Gemeinsamkeiten: Licht- und Temperaturprofile sind konstant eingestellt und die untersuchten Stämme stammen überwiegend aus den Ordnungen Nostocales und Oscilatoriales sowie der Gattung Nostoc15. Diese Studien zeigten, dass der EPS-Gehalt ein stammspezifisches Merkmal ist.

Die in Kultursammlungen vorhandene biologische Vielfalt kann eine Rohstoffquelle für die Erforschung biotechnologischer Anwendungen sein22. Die Blue Biotechnology and Ecotoxicology Culture Collection (LEGE-CC) ist eine Biobank für Cyanobakterien und Mikroalgen. Derzeit umfasst es mehr als 700 nicht-axenische Cyanobakterienstämme, von denen 80 % aus portugiesischen Umgebungen isoliert wurden23.

Die Bioprospektion unter prozessorientierten Bedingungen ist eine nützliche Möglichkeit, kritische Prozessfaktoren zu bestimmen und sie zur Entdeckung angepasster mikrobieller Ressourcen zu nutzen und gleichzeitig industriellen Szenarien näher zu kommen6,24. Portugal war ein Vorreiter bei der Produktion und Vermarktung von Mikroalgen in Europa und verfügt über die älteste Produktionseinheit. Heute ist dieses Segment durch mehrere industrielle und handwerkliche Produzenten gut vertreten25. Das portugiesische Klima verfügt über kompatible Bedingungen, die für die industrielle Produktion von Cyanobakterien erforderlich sind.

In diesem Zusammenhang wurden nicht-axenische Cyanobakterienstämme auf relevante industrielle Bedingungen untersucht, um ihr Potenzial als Quelle von EPS-Biopolymeren und ungiftiger Biomasse für biotechnologische Anwendungen zu bestimmen und zu charakterisieren. Zu diesem Zweck wurden die Stämme zunächst hinsichtlich ihrer Produktivität und ihres Proteingehalts bewertet, wenn sie in Photobioreaktoren (PBR) gezüchtet wurden, wobei das Licht und die Temperaturen im Frühling in Zentralportugal simuliert wurden. Anschließend wurde die Biomasse der unter diesen Kriterien produktivsten Stämme auf ihre ungefähre Zusammensetzung (Protein, Kohlenhydrate, Lipide und Asche) untersucht. Stämme, die RPS produzieren, wurden priorisiert. Diese wurden durch den Nachweis von Genen, die an der Biosynthese dieser bekannten Toxine beteiligt sind, mit traditionellen molekularen Methoden auf das Vorhandensein von Cyanotoxinen überprüft und durch ESI-LC-MS/MS bestätigt. Ihre Polysaccharide wurden teilweise durch GC/MS-EI von Trimethylsilyl-O-glycosiden für die Monosaccharidzusammensetzung und HPSEC-MALS für die Molekulargewichtsschätzung charakterisiert.

Ein Vorscreening von 63 Cyanobakterienstämmen (Daten nicht gezeigt) ermöglichte die Auswahl von 25 Stämmen durch Anfärben neutraler Polysaccharide unter Verwendung der Alcianblau-Formulierung. Eine qualitative Charakterisierung dieser fünfundzwanzig Stämme ist in der Ergänzungsmaterialtabelle S1 (SM) dargestellt. Insgesamt waren neutrale Polysaccharide größtenteils als CPS an die Zellstruktur gebunden, während einige keine Nähe zu den Cyanobakterienzellen aufwiesen und zur RPS-Fraktion gehörten.

Die Identifizierung der ausgewählten Stämme (SM-Tabelle S2) zeigt eine hohe Diversität unter ihnen, die fünf Ordnungen umfasst: Chroococcales (54 %), Synechococcales (25 %), Nostocales (13 %), Chroococcidiopsidales (4 %) und Oscillatoriales (4 %). . Die in Abb. 1 dargestellte Studienprobe umfasst Cyanobakterien aus verschiedenen Lebensräumen: Süßwasserumgebung (81 %), marinen Ursprungs (15 %) und Land (4 %).

Phylogenetischer Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit basierend auf 183 partiellen 16S-rRNA-Gensequenzen von Cyanobakterien. Als Fremdgruppe wurden Gloeobacter violaceus PCC 7421 und G. violaceus PCC 8105 verwendet. Die in dieser Arbeit verwendeten LEGE-CC-Stämme sind fett und mit einem schwarzen Kreis gekennzeichnet. Die verschiedenen Farbsegmente repräsentieren die Sortenplatzierung auf der folgenden Bestellebene26. Bootstrap-Werte über 50 % werden an den Knoten angezeigt.

Die ausgewählten Cyanobakterienstämme wurden frühlingssimulierten Bedingungen mit einem Temperaturbereich von 11–22 °C, einer maximalen Lichtintensität von ~ 1200 µmol m−2 s−1 und einer durchschnittlichen Tageslänge von 14 Stunden ausgesetzt. Einundzwanzig der fünfundzwanzig Stämme konnten unter diesen Kulturbedingungen gedeihen, während vier ausgeschlossen wurden, weil sie ihre Biomasse während der Kultivierung am fünfzehnten Tag nicht verdoppeln konnten, nämlich Chrocodiopsales cyanobacterium LEGE 14612, Chroococcales cyanobacterium LEGE 16638 und Microcystis aeruginosa LEGE 91353, Synechococcales cyanobacterium LEGE 17617. Darüber hinaus wurden weitere fünf Stämme aufgrund einer Kontamination durch Mikroflagelaten um den achten Tag der Kultivierung vom Screening ausgeschlossen: Cyanobium gracile LEGE 09399, Geminocystis sp. LEGE 16574, Chroococcales cyanobacterium LEGE 18573, Pegethrix sp. LEGE 18685 und Synechocystis sp. LEGE 16643. Insgesamt wurden neun der fünfundzwanzig Stämme von den folgenden Schritten ausgeschlossen.

Die Kombination von Diel-Licht und Temperatur wirkte sich direkt auf die Biomasseproduktivität von Cyanobakterien aus, wie in Abb. 2 dargestellt. Es können zwei virtuelle Gruppen unterschieden werden: eine weniger produktive Gruppe (< 0,10 g L−1 Tag−1), bestehend aus neun Stämmen und a produktivere Gruppe (≥ 0,1 g L−1 Tag−1), bestehend aus sieben Stämmen. Interessanterweise besteht die produktivste Gruppe aus allen untersuchten Meeresstämmen, die größtenteils zu den Gattungen Synechocystis und Cyanobium gehören (Synechocystis salina LEGE 000038, Synechocystis salina LEGE 00041, Synechocystis salina LEGE 06099, Cyanobium sp. LEGE 06140) und drei Süßwasserstämmen (Synechocystis sp. LEGE 06140). . LEGE 07367, Cyanobium sp. LEGE 15611, Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970). Unter diesen erreichten die beiden Cyanobium-Stämme die höchste Biomasseproduktivität (Abb. 2).

Biomasseproduktivität von Cyanobakterienstämmen für den Zeitraum von 15 Tagen. Die Biomasseproduktivität wird in g L−1 Tag−1 ± Standardfehler (n = 3) ausgedrückt.

Die am wenigsten produktive Gruppe wird durch neun Stämme der Ordnungen Chroococcales (4), Synechococcales (2), Nostocales (3) und Oscilatoriales (1) repräsentiert, nämlich Synechocystis sp. LEGE 06079, Tolypothrix sp. LEGE 11397, Desmonostoc muscorum LEGE 12446, Chroococcales cyanobacterium LEGE 17607, Altericista sp. LEGE 17690, Synechococcales cyanobacterium LEGE 19969, Planktothrix sp. LEGE XX280, Nostocales cyanobacterium LEGE 18510 und Chalicogloea sp. LEGE 18580.

Abbildung 3 zeigt den Proteingehalt der im PBR produzierten Cyanobakterien-Biomasse, mit Ausnahme von Chalicogloea sp. LEGE 18580, Tolypothrix sp. LEGE 11397 und Desmonostoc muscorum LEGE 12446 aufgrund unzureichender Biomassemenge. Insgesamt variierte der Proteingehalt der Cyanobakterien-Biomasse zwischen 20 und 40 % Trockengewicht (DW), und es gab weltweit signifikante Unterschiede (Kruskal-Wallis-Test, Chi-Quadrat = 36,26; df = 12, p-Wert < 0,001). Der Post-hoc-Nemenyi-Test ergab signifikante Unterschiede zwischen dem Stamm LEGE 19969 (der mit dem höheren Gehalt, 43 % DW) und den beiden Stämmen LEGE 06140 und LEGE 17690 (die beiden mit dem niedrigeren Gehalt, 24 % bzw. 24,7 %).

Proteingehalt in Prozent des Trockengewichts (DW) der Cyanobakterienstämme. Unterschiedliche Buchstaben weisen laut Nemenyi-Post-hoc-Test auf signifikante Unterschiede zwischen den Stämmen hin. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) angegeben.

Die durch den Spearman-Koeffizienten bestimmte Korrelation zwischen Biomasseproduktivität und Protein war negativ, aber nicht signifikant (\(\rho\) = − 0,29; S = 12.790; p-Wert = 0,07).

Die produktivsten Cyanobakterienstämme (vier Meeres- und drei Süßwasserstämme) wurden ausgewählt und eine vollständige Zusammensetzung der Biomasse in der Nähe durchgeführt (Abb. 4). In anderen Fällen wurde eine nichtmetrische mehrdimensionale Skalierung (NMDS) angewendet, um Unähnlichkeit zwischen Stämmen zu erkennen (Abb. 5), die einen Spannungswert von 9,22 × 10–5 ergab.

Biomassenahe Zusammensetzung der produktivsten Cyanobakterienstämme (n = 3).

Diagramm der nichtmetrischen mehrdimensionalen Skalierung für die biochemische Zusammensetzung der sieben Stämme.

Der Proteingehalt dieser Meeres- und Süßwasserstämme variierte von den höchsten Anteilen für Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 (41 % DW) und dem marinen Synechocystis salina LEGE 00041 (41 %), während der niedrigste Gehalt für marines Cyanobium sp. beobachtet wurde. LEGE 06140 (24 % DW).

Der relative Lipidgehalt war bei marinem Cyanobium sp. am niedrigsten. LEGE 06140 (8 % DW) und am höchsten für Süßwasser-Cyanobium sp. LEGE 15611 (12 % DW) (Abb. 4). Synechocystis salina-Stämme (LEGE 00038, LEGE 00041 und LEGE 06099) zeigten einen ähnlichen Gesamtlipidgehalt (11–12 % DW), wohingegen Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 nur 10 % DW der Gesamtlipide aufwies.

Der Aschegehalt bei Meeresstämmen variierte zwischen 10,5 % DW (Cyanobium sp. LEGE 06140) und 24,3 % DW (Synechocystis salina LEGE 00038), während der Aschegehalt bei Süßwasserstämmen zwischen 5 % (Cyanobium sp. LEGE 15611) und 6,9 % DW schwankte (Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970).

Der Kohlenhydratgehalt war bei marinem Cyanobium sp. am höchsten. (LEGE 06140), was fast 60 % DW entspricht, während der niedrigste Wert für Synechocystis salina LEGE 00041 (28,1 % DW) gefunden wurde. Interessanterweise enthielten Süßwasserstämme im Durchschnitt mehr Kohlenhydrate als Meeresstämme. Darüber hinaus ist das marine Cyanobium sp. LEGE 06140 und Süßwasser-Cyanobium sp. LEGE 15611 zeigte eine sehr ähnliche Kohlenhydratakkumulation: 57 % DW bzw. 54 % DW. Die drei Synechocystis salina-Stämme (LEGE 00038, 00041 und 06099) zeigten unterschiedliche Kohlenhydratwerte (28–39 % DW). Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 verzeichnete nahezu gleichmäßige Anteile an Kohlenhydraten und Proteinen.

Die NMDS-Analyse (Abb. 5) zeigte die Biomassezusammensetzung von Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 und Synechocystis sp. LEGE 07367 waren sehr ähnlich, mit einer Überlappung ihrer Positionen (Abb. 5). Diese beiden Stämme sind mit einem hohen relativen Protein- und Lipidgehalt verbunden (Abb. 4). Auch Synechocystis salina LEGE 00041 war mit diesen beiden Komponenten assoziiert, sein höherer Aschegehalt zeigte jedoch eine Verschiebung in Richtung dieser Komponente in der ersten Dimension (Abb. 5). Der Synechocystis salina-Stamm LEGE 00038 zeichnete sich durch seinen relativ hohen Aschegehalt aus (Abb. 4) und schien damit assoziiert zu sein (Abb. 5). Synechocystis salina LEGE 06099 wies das ausgewogenste Verhältnis aller Elemente auf und kam dem Ursprung am nächsten ( Abb. 5). Die Cyanobium-Stämme LEGE 15611 und LEGE 06140 waren mit Kohlenhydraten assoziiert, da sie den größten Anteil aufwiesen (Abb. 4).

Eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde erstellt, um die Beziehungen zwischen der biochemischen Zusammensetzung der produktivsten Stämme zu untersuchen (Abb. 6). Die Ergebnisse des PC1 erklären 65,5 % der Gesamtvarianz. Diese Komponente korrelierte negativ mit dem Kohlenhydratgehalt und positiv mit dem Protein-, Lipid- und Aschegehalt. Die PC2-Achse erklärt 22,3 % der Gesamtvarianz und korreliert größtenteils positiv mit Lipiden und Proteinen und negativ mit Asche. Das bemerkenswerteste Muster war der negative Zusammenhang zwischen dem Kohlenhydratgehalt und allen anderen Komponenten. Der PC1 zeigte die Charakterisierung der Stämme LEGE Cyanobium sp. LEGE 15611 und Cyanobium sp. LEGE 06140 zeigte im Vergleich zu allen anderen Stämmen einen höheren relativen Kohlenhydratgehalt; Ersteres war vergleichsweise reicher an Lipiden und Proteinen, während letzteres ärmer an Lipiden und Proteinen und reicher an Asche war. Synechocystis salina LEGE 00041 korrelierte stärker mit Lipiden und Proteinen. Der PC2 bestätigte zwei Gruppen mit gegensätzlichen Mustern hinsichtlich Lipid und Protein auf der einen Seite und Asche auf der anderen Seite. Synechocystis sp. LEGE 07367 und Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 waren reicher an Proteinen und Lipiden, und die Stämme Synechocystis salina (LEGE 00038 und 06099) waren reicher an Asche.

PCA biochemischer Komponenten für die produktivsten Cyanobakterienstämme.

Am Ende der Kultivierung wurden neutrale Polysaccharide gefärbt und mikrofotografiert, wie in Abb. 7 dargestellt. Die marinen Mikrofotografien zeigten eine Ähnlichkeit zwischen der EPS-Färbung, die aus Synechocystis salina-Stämmen bestand. Im Gegensatz dazu zeigten die Süßwasser-Cyanobium-Stämme einen Unterschied zwischen der Verbindung von Zellen und EPS-Fraktionen. Synechocystis sp. LEGE 07367 zeigte eine Schleimschicht, die seine Zellen umgab, während die von Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 zeigte, was wir zwischen RPS und CPS unterscheiden konnten. Die EPS-Produktion in Form von RPS wurde nur für zwei Süßwasserstämme nachgewiesen, Synechocystis sp. LEGE 07367 und Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970. Der volumetrische und massive Roh-RPS-Ertrag war für Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 höher, wie in Tabelle 1 gezeigt.

Mikrofotografien von Cyanobakterien-EPS nach PBR-Kultivierung, gefärbt mit Alcianblau-Formulierung, gruppiert nach Herkunft. Die Vergrößerung reichte von 100- bis 400-fach und wurde an die Zellgröße angepasst, um das Hauptprofil der EPS um die Zellen herum zu erfassen. Die Buchstaben entsprechen: (a) Synechocystis salina LEGE 00038, (b) Synechocystis salina LEGE 00041, (c) Synechocystis salina LEGE 06099, (d) Cyanobium sp. LEGE 06140, (e) Synechocystis sp. LEGE 07367 (f) Cyanobium sp. LEGE 15611 und (g) Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970.

Die Zusammensetzungen in Monosacchariden von Cyanobakterien-RPS aus Synechocystis sp. LEGE 07367 und Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 wurden mittels GC/MS-EI durchgeführt (SM Abbildung S2). Die molaren % der im cyanobakteriellen RPS nachgewiesenen Monosaccharide sind in Tabelle 2 aufgeführt. Beide RPS-Proben sind glukosereich, was darauf hinweist, dass diese Polysaccharide zusammen mit anderen neutralen Zuckern auf Glucan basieren. Das RPS von Synechocystis sp. besteht aus den vier Hauptmonosacchariden Glucose (Glc), Galactose (Gal), Rhamnose (Rha) und Mannose (Man), während Spuren (Mol-% < 1 %) von Xylose (Xyl), Fucose (Fuc) und Ribose (Rib) vorhanden sind. wurden festgestellt. Das RPS des Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 präsentiert auf die gleiche Weise vier Hauptmonosaccharide Glc, Rha, Gal und Man mit Spuren von Xyl und Fuc.

Die Mw-Verteilung der RPSs wurde durch HPLC-SEC/MALS-Analyse bestimmt, die Experimente wurden in 0,1 mol L−1 NaNO3 durchgeführt (SM, Abbildung S3). Die Polysaccharide wurden zwischen 16 und 23 ml eluiert, was dem typischen Bereich für Fraktionen mit hohem Molekulargewicht entspricht, und zeigten unterschiedliche Elutionsprofile. Tatsächlich ist das LS-Signal von Synechocystis sp. LEGE 07367 kehrt am Ende der Elution nicht auf das Ausgangsniveau zurück, was im Gegensatz zum RPS von Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 auf ein Tailing-Phänomen der analysierten Verbindung hinweist. Dies weist also auf eine nicht ideale Elution hin, die durch eine langsame Elution von Molekülen gekennzeichnet ist unabhängig von ihrem hydrodynamischen Volumen, das die Trennung des gesamten Molekulargewichts in den Proben beeinflussen kann. Um die Auflösung von RPS zu verbessern, wurden verschiedene Parameter getestet (Konzentration, Temperatur, hohe Homogenisierung).

Der Konzentrationsdetektor (Brechungsindexdetektor) und der verwendete dn dc−1 (0,150) ermöglichten die Berechnung der Probenwiederfindung im Vergleich zur ursprünglichen Masse der injizierten Probe. Probengewinnung aus Synechocystis sp. LEGE 07367 war niedriger (< 10 %) als Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 (ca. 30 %). Die Filtration der Probe durch einen Filter mit kleiner Porengröße (≤ 0,45 μm) kann zu Probenverlust führen, wenn RPS mit hohem Molekulargewicht als Aggregate vorhanden sind. Diese geringen Ausbeuten könnten auch auf Materialverlust zurückzuführen sein, der durch Probenadsorption aufgrund von Wechselwirkungen mit dem Säulenpackungsmaterial verursacht wird, wie das LS-Signal nahelegt.

Eine Zusammenfassung der Mw-Verteilung von Synechocystis sp. LEGE 07367 und Chroococcales cyanobacterium LEGE 19.970 RPS sind in Tabelle 3 aufgeführt. Beide RPS zeigten einen Polydispersitätsindex in der gleichen Größenordnung. Das durchschnittliche Mw des RPS von Synechocystis sp. LEGE 07367 ist höher als Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 RPS. In den RPS-Fraktionen beider Cyanobakterien wurde ein subtiles UV-Signal nachgewiesen (Daten nicht gezeigt).

Cyanobakterielle Toxine wurden für beide RPS-produzierenden Stämme untersucht (Tabelle 4). Der Nachweis über die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde für sechs Gene durchgeführt, die mit der Biosynthese von vier Cyanotoxinen (Microcystin, Saxitoxin, Cylindrospermopsin und Anatoxin) verbunden sind. Obwohl für beide Süßwasserstämme keine Gene nachgewiesen wurden, wurde das stx-Gen zunächst für Synechocystis sp. nachgewiesen. LEGE 07367. Die Sequenzierung des amplifizierten PCR-Produkts entsprach nicht dem Saxitoxin-verwandten Gen. Um auf die Abwesenheit dieses Toxins schließen zu können, wurde eine ESI-LC-MS/MS-Analyse sowohl für die Biomasse als auch für den Überstand von Synechocystis sp. durchgeführt. LEGE 07367 Kultur. Die STX-Standardlösung zeigte eine Retentionszeit (RT) von 3,25 min und Massenfragmente von 282, 266, 240, 221, 204 und 144 m/z (Abbildung S4). Die Synechocystis sp. LEGE 07367-Zellextrakte und Medien-Gesamtionenchromatogramme wurden im LC-Signalbereich mit RT 2–10 Minuten analysiert und das gesamte Massenspektrum der kollisionsinduzierten Dissoziation (CID) zeigte nicht das für STX oder Neosaxitoxin erwartete Fragmentmuster (Abbildung S4 C–F). ). Insgesamt belegen die Beweise die Abwesenheit von STX und Neosaxitoxin in den Zellen und Medien von Synechocystis sp. LEGE 07367. Daher sind beide Süßwasserstämme frei von bekannten Cyanotoxinen.

In dieser Studie wurde ein neuartiger Weg zur Bioprospektion von EPS-produzierenden Stämmen untersucht, indem diese industriell relevanten Bedingungen (Licht und Temperatur) ausgesetzt wurden.

In der Roscoff Culture Collection wurde eine Screening-Studie zur reichen Artenvielfalt durchgeführt, bei der fünf verschiedene Ordnungen untersucht wurden, wodurch das Wissen über Cyanobakterien-RPS-Produzenten unter konstantem Licht und konstanter Temperatur erweitert wurde. Synechococcus sp. RCC 2380 wurde als RPS-produzierender Stamm hervorgehoben, der eine angemessene Produktivität von 4 mg L pro Tag aufweist – 127. Unsere Studie trug dazu bei, die überprüfte taxonomische Vielfalt über fünf Ordnungen aus mehreren Gattungen zu erhöhen. Bei der Bioprospektion von EPS-produzierenden Stämmen konzentrierten sich Berichte stets auf EPS als einzelnes Produkt28,29,30,31,32,33, während einige die Biomasseproduktion34,35,36 und wenige biochemische Parameter37 berücksichtigten. Die Verwendung von dielektrischem Licht und Temperatur zur Simulation des realen Klimas ist für die industrielle Umsetzung dieser photoautotrophen Fabriken von entscheidender Bedeutung38. Das Verständnis, welche Stämme sich besser an diese Bedingungen anpassen, kann dazu beitragen, den Energieaufwand für die Prozesssteuerung zu reduzieren. Daher ist die Biomasseproduktivität eine wertvolle Messgröße zur Beurteilung des Potenzials dieser Stämme. Spirulina sp. LEB-18 RPS-produzierende Pflanzen zeigten beim Wachstum in einem 250-L-Raceway-Tank eine maximale Biomasseproduktivität von 0,02 g L−1Tag−139. Unsere Studie ergab maximale Biomasseproduktivitäten von etwa 0,2 g L−1 Tag−1. Es wird jedoch erwartet, dass diese sinken, wenn das Anbauvolumen zunimmt. Die Nutzung anderer wertvoller Metaboliten über EPS hinaus kann aus einer einzigen Kultivierung mehrere Produkte liefern und den gesamten Bioprozess aufwerten. Einige Studien haben EPS und Pigmente40,41 oder die Produktion von Bioethanol42 untersucht. Unsere Studie konzentrierte sich auf die makromolekulare Zusammensetzung der Biomasse, die einen allgemeinen Überblick über das biochemische Profil jedes Cyanobakteriums bietet. Cyanobium sp. LEGE 06133 wurde als reichhaltige Quelle für Pigmente (Phycobiliproteine und Carotinoide) mit einer Biomasseproduktivität von 0,14 g L−1 Tag−1 unter optimierten Bedingungen hervorgehoben43. Die beiden produktivsten Cyanobium-Stämme zeigten eine höhere Biomasseproduktivität als der unter optimierten Bedingungen angebaute. Die anderen produktivsten Stämme, die in dieser Arbeit untersucht wurden, gehören zur Gattung Synechocystis. Synechocystis salina gilt als wertvolle Quelle für Antioxidationsmoleküle44 und Polyhydroxyalkanoate45, was sie zu potenziellen Kandidaten für ein Bioraffineriekonzept macht46.

Die Nachfrage nach alternativen Proteinquellen steigt, und Cyanobakterien stehen als eine davon im Rampenlicht47. Die vorliegende Studie untersuchte erstmals den Proteingehalt der folgenden Gattung: Chroococcales cyanobacterium LEGE 17607, Altericista sp. LEGE 17690, Synechococcales cyanobacterium LEGE 19969, Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970, Tolypothrix sp. LEGE XX280 und Nostocales cyanobacterium LEGE 18510. Unsere untersuchten Stämme hatten im Vergleich zu anderen gut untersuchten Cyanobakteriengattungen, nämlich Anabaena (43–56 % DW), Arthrospira (17–72 % DW), Aphanizomenon (62 % DW), einen relativ geringeren Proteingehalt ), Synechococcus (46–63 % DW)48. Obwohl es unterschiedliche Routinemethoden zur Proteinquantifizierung gibt (Stickstoffanalyse, kolorimetrische Tests und Summe der Anhydroaminosäuren), wurden Inkonsistenzen zwischen den mit der einen oder anderen Methode erzielten Ergebnissen gezeigt, sodass Schlussfolgerungen über den tatsächlichen Proteingehalt vorsichtig sein müssen48.

Das Modell-Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 weist einen gemeldeten Proteingehalt auf, der zwischen 32 und 57 % DW49 liegt, ähnlich dem für Synechocystis-Stämme gefundenen (34–40 % DW). Die Cyanobium sp. LEGE 06113 zeichnete sich durch einen niedrigen Proteingehalt50 aus, der dem hier für die Cyanobium-Stämme erhaltenen Wert entsprach.

Die produktivsten Stämme zeigten einen ähnlichen Lipidgehalt. Nordische Süßwasser-Cyanobakterien, die unter synthetischem Abwasser gezüchtet wurden, zeigten einen ähnlichen Gesamtlipidgehalt (6,7 und 23,5 % DW)51. Das Süßwasser-Cyanobium sp. CACIAM06 zeigte einen Lipidgehalt von 5,5 % DW52, niedriger als der für Süßwasser-Cyanobium sp. beobachtete Wert. LEGE 15611.

Der unterschiedliche Aschegehalt bei Meeresstämmen im Vergleich zu Süßwasserstämmen hängt mit der höheren Salzkonzentration im Meeresmedium zusammen.

Es wird angenommen, dass die Ansammlung von Kohlenhydraten als Kohlenstoffsenke aus der Photosynthese fungiert, wenn Bedingungen mit Nährstoffmangel auftreten. Darüber hinaus können Cyanobakterien unter nicht erschöpften Nährstoffbedingungen aus einem niedrigen Kohlenhydratgehalt (10–30 % DW) bestehen53. Unsere Ergebnisse zeigten, dass 5 von 7 Cyanobakterien einen Kohlenhydratgehalt von mehr als 30 % DW aufwiesen, während die anderen beiden Werte nahe diesem virtuellen Maximum aufwiesen, was darauf hindeutet, dass sich die Kulturen möglicherweise am Ende der Wachstumsphase unter nährstoffarmen Bedingungen befinden. In der vorliegenden Arbeit wurde für Süßwasserstämme im Vergleich zu Meeresstämmen ein höherer durchschnittlicher DW-Anteil an Kohlenhydraten festgestellt. Es gibt jedoch nicht genügend Literatur, um diesen Aspekt zu diskutieren.

Der NMDS-Stresswert war erheblich niedrig, was auf eine sehr gute Anpassung hinweist. Dies liegt wahrscheinlich an der relativ geringen Anzahl von Objekten in der Analyse und den Dimensionen zur Feststellung der Unähnlichkeiten. Dadurch ist die Reduktion auf ein zweidimensionales Unähnlichkeitsdiagramm sehr einfach und robust.

Die PCA-Analyse zeigte eine negative Korrelation zwischen Kohlenhydrat- und Proteingehalt. Eine frühere Studie zur Biomasse von Cyanobakterien kam zu ähnlichen Ergebnissen54. Die negative Korrelation zwischen Kohlenhydrat- und Lipidgehalt wurde für sieben Cyanobakterienstämme beschrieben, was mit zuvor erhaltenen Ergebnissen übereinstimmt55,56. Bisher hat keine Studie den Zusammenhang zwischen Lipid- und Proteingehalt in Cyanobakterien untersucht, wohingegen unsere Studie auf diesen positiven Zusammenhang für beide Stämme der Meeres- und Süßwasserumgebung hinweist. Unsere NMDS stimmen mit der beobachteten PCA-Korrelation überein.

Die in dieser Studie erhaltenen Kohlenhydratwerte entsprechen intrazellulären Kohlenhydraten und CPS, da bei der Biomasseernte kein Waschschritt durchgeführt wurde. Somit können wir davon ausgehen, dass Cyanobium sp. Stämme (LEGE 06140 und LEGE 15611) sind entweder reich an intrazellulären Kohlenhydraten oder CPS. Abhängig von ihrem Standort könnten diese Kohlenhydrate als Ausgangsstoffe für Bioenergiezwecke57 oder, im Fall von CPS, für die Herstellung von Extrakten für Kosmetika oder Cosmeceuticals58 dienen.

Die in dieser Arbeit verwendete EPS-Nachweismethode wurde häufig zum Nachweis von Cyanobakterien-EPS59,60,61 angewendet. Wie auf den Mikrofotografien zu sehen ist, gibt es keine klare Unterscheidung zwischen den RPS-produzierenden Stämmen und den nicht produzierenden Stämmen, da diese Färbung nicht molekulargewichtsspezifisch ist. Fraktionen mit geringerer Größe können ebenfalls gefärbt werden. Die in dieser Arbeit angewandte Methodik zielt jedoch auf hohe Molekulargewichte ab . Daher diente der Färbeansatz bei den produktivsten Stämmen als Indikator für die EPS-Architektur, an der die Cyanobakterienzellen beteiligt waren. Der reiche Stoffwechsel von Cyanobakterien ermöglicht die Verwendung verschiedener Nährstoffquellen, die sich auf ihre Physiologie und Leistung auswirken56. Die Verwendung von extrahiertem Meeresschlamm in af/2-modifizierten Medien förderte eine EPS-Produktivität von 1,3 g L−1 Tag−1 beim Stamm der Gattung Cyanothece, es wurden jedoch keine Einblicke in die Biomasseproduktivität oder -zusammensetzung erwähnt30. Trotz der überraschenden EPS-Produktivität müssen die Auswirkungen auf die Nutzung dieser Ressource im großen Maßstab berücksichtigt werden.

Einige der am häufigsten untersuchten Cyanobakterien für die EPS-Produktion wurden unter diazotrophen Bedingungen gezüchtet28,31,33,36. Diazotrophe Bedingungen förderten höhere RPS-Produktivitäten als die in dieser Studie erzielten, insbesondere für axenische Kulturen von Nostoc sp. PCC 7413 und Nostoc sp. PCC 8109 etwa 47 mg L-1 Tag-1 bzw. 30 mg L-1 Tag-128. Das Fehlen einer Stickstoffquelle kann enorme wirtschaftliche Auswirkungen auf die mit Nährstoffen verbundenen Kosten haben. Allerdings ist die Empfindlichkeit des Nitrogenase-Enzyms gegenüber Sauerstoff ein Faktor, der die Wachstumsrate der Cyanobakterien-Biomasse beeinflusst, und muss auf stammspezifischer Ebene berücksichtigt werden, bevor eine industrielle Nutzung in Betracht gezogen wird62. Unsere Studie untersuchte nicht stickstofffixierende Cyanobakterien aus einem breiten Spektrum von Cyanobakterienordnungen unter Verwendung einer industriell optimierten Version von f/2-Medien. Es wird erwartet, dass diese Formulierung im Vergleich zu vollständigeren Versionen von Cyanobakterien-Wachstumsmedien kostenmäßig wettbewerbsfähig ist. Die RPS-Produktivitäten waren unter portugiesischem Klima erheblich höher im Vergleich zu denen von Vertretern der Ordnungen Nostocales, Chroococcales, Synechococcales, Oscillatoriales und Spirulinares Pleurocapsales, die größtenteils unter stabilen Licht- und Temperaturbedingungen angebaut wurden27,29,32,34,35,37,63 . Beide erhaltenen RPS basieren auf Glucan, entsprechend der für Cyanobakterien beschriebenen EPS-Zusammensetzung64. Es wurde jedoch keine Uronsäure nachgewiesen, was ein weniger häufiges Merkmal dieser EPS9,65 darstellt. Als Standards wurden zwei gängige Uronsäuren (GlcA und GalA) mit einer Nachweisgrenze von 0,5 µg µL−1 verwendet, was für den Nachweis ihrer Anwesenheit ausreichen sollte. Von Cyanobakterien sind weniger verbreitete Uronsäuren zu erwarten, sodass weitere Experimente erforderlich sind, um das Fehlen dieser Zuckersäuren zu bestätigen. Die Durchführung eines Reduktionsschritts vor der Derivatisierung mit TMS, NMR 13C oder Ionenchromatographie ohne Derivatisierung sind einige der anzuwendenden Techniken.

Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 zeigte vier Hauptmonosaccharide, von denen 80 % Glucose und Rhamnose waren, was auf das Vorhandensein eines Rhamnoglucan-RPS schließen lässt. Es wurde beschrieben, dass diese beiden Monosaccharide im cyanobakteriellen EPS64 allgegenwärtig sind.

Synechocystis sp. Die Monosaccharidzusammensetzung von LEGE 07367 zeigte im Vergleich zu Synechocystis PCC 6803 und PCC 6714 eine unterschiedliche Zusammensetzung, obwohl Glukose ein Hauptmonosaccharid war, wurden insgesamt 11–12 Monosaccharide und Uronsäure identifiziert66. PCC 6714 RPS hatte einen Glukosegehalt, der eher dem von Synechocystis sp. ähnelte. LEGE 07367 RPS. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der Wildtyp von PCC 6803 ausgewogenere Mengen an Hexosen aufwies, während abgeleitete Mutanten höhere Mengen an Hexosen aufwiesen, insbesondere an Glucose, was der RPS-Zusammensetzung von LEGE 0736767,68 näher zu sein scheint. Genetische Unterschiede zwischen diesen Stämmen oder die angewandten Kulturbedingungen könnten für die beobachtete Variabilität in der Monosaccharidzusammensetzung verantwortlich sein.

Das für beide RPS gefundene durchschnittliche Molekulargewicht liegt innerhalb der für Cyanobakterium EPS69 beschriebenen Bereiche. Synechocystis sp. Das durchschnittliche Molekulargewicht von LEGE 07367 RPS stimmt mit dem für Synechocystis sp. vorgeschlagenen Molekulargewicht überein. PCC 680370.

Eine kleinere RPS-Fraktion wurde für das Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 mit durchschnittlich 636 kDa gefunden. Das Fehlen eines Reinigungsschritts für Synechocystis sp. LEGE 07367 RPS könnte den Polydispersitätsindex beeinflussen. Die Leitfähigkeits- und Salzgehaltsparameter des RPS waren für die Monosaccharidanalyse geeignet und somit wurde ein breiterer geschätzter Bereich des Molekulargewichts erhalten. Mota und Mitarbeiter18 haben beobachtet, dass das RPS aus Cyanothece CYY010 eine unterschiedliche relative Häufigkeit aufweist, während die meisten Polymerfraktionen zwischen 50 kDa und 343,2 Da lagen, jedoch 30 % der RPS-Fraktion Polymere der MDa-Größe enthielten. Die Vielfalt an Monosacchariden und die Anzahl der Molekulargewichtsfraktionen zeigen deutlich die Komplexität des RPS. Darüber hinaus können diese gefundenen Strukturmerkmale durch die Extraktionsmethoden und die angewandten Analysemethoden beeinflusst werden9,71. Reinigungsschritte können dabei helfen, die Strukturen dieser Polysaccharide aufzuklären und besser zu verstehen, wie sie miteinander in Beziehung stehen.

Die in beiden RPS-Fraktionen nachgewiesenen Proteineinheiten werden häufig für Cyanobakterien-RPS9,72 beschrieben.

Cyanotoxine sind für negative Auswirkungen auf die Ökosysteme verantwortlich, könnten jedoch auch ein Produkt mit hohem Mehrwert für den Standardmarkt oder biomedizinische Anwendungen sein73. Es wurde festgestellt, dass einige Synechocystis-Stämme starke Neurotoxin- und Hepatotoxinproduzenten sind74. Beim Stamm Synechocystis sp. LEGE 07367 wurde die Abwesenheit von Cyanotoxinen bestätigt, ebenso im Stamm Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970. Dies begründet ihr Interesse für bestimmte biotechnologische Anwendungen. Sicherlich werden prozessorientierte Screenings unerforschter Cyanobakterienstämme eine Rolle bei der Implementierung von Cyanobakterien-basierten Bioprozessen für den Biotechnologiesektor in Portugal spielen.

Das Screening von Cyanobakterien unter Verwendung von Diellicht und der Temperatur des portugiesischen Klimas ermöglichte die Unterscheidung von Stämmen aus einer reichhaltigen taxonomischen Gruppe anhand ihrer Leistung, Biomassezusammensetzung und Fähigkeit, Polysaccharide auszuscheiden und Cyanotoxine zu produzieren.

Zwei Cyanotoxin-freie Cyanobakterienstämme, Synechocystis sp. LEGE 07367 und Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 wurden als schnell wachsend (0,14 bzw. 0,12 g L−1 Tag−1) identifiziert, die lösliches, glucanreiches RPS mit hohem Molekulargewicht von 2910 kDa bzw. 636 kDa liefern. Ihre kohlenhydratreiche (> 42 % DW) und proteinreiche (> 36 % DW) Biomassezusammensetzung bietet Potenzial für ein breites Anwendungsspektrum.

Schnell wachsende, aber nicht RPS-produzierende Stämme [Synechocystis salina (3) und Cyanobium-Stämme (2)] sollten aufgrund ihres hohen Kohlenhydrat- und/oder Proteingehalts, die zusammen 65–83 % des Trockengewichts ausmachen, für das Bioraffineriekonzept in Betracht gezogen werden .

Diese Arbeit bietet einen Einstiegspunkt für die zukünftige Kultivierung von Cyanobakterien im Freien mit natürlichem Sonnenlicht und reduzierter Temperaturkontrolle. Das LEGE-CC zeigte sein Potenzial als Quelle unerforschter Vielfalt, nachdem potenziell neue Gattungen von Cyanobakterien entdeckt wurden, darunter ein RPS-Produzent.

63 Cyanobakterienstämme wurden von LEGE-CC bereitgestellt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Stämme unter Kultursammelbedingungen gehalten und durch Lichtmikroskopie mit Alcianblau-Färbung auf neutrale Polysaccharide untersucht34. Kurz gesagt, die Stämme (stationäre Phase) wurden in einem 12/12-stündigen Hell/Dunkel-Zyklus (L/D), einer Lichtintensität < 20 µmol m−2 s−1 (Fluoreszenzlicht, Acardia) und 19 °C gehalten und darin gehalten ein stammabhängiges Kulturmedium: Z8-Medium75, Z8-Medium ergänzt mit 25‰ synthetischen Meersalzen (Salz Tropical Marin, Berlin, Deutschland) und 1‰ mit Vitamin B1275 oder BG11076. Kulturen und Alcianblau-Formulierungen wurden im Verhältnis 1:1 gemischt, und unter Verwendung eines Leica DMLB-Lichtmikroskops, das an eine Leica ICC50 HD-Digitalkamera (Leica Microsystems, Deutschland) gekoppelt war, wurde das Vorhandensein neutraler Polysaccharide beobachtet.

Anschließend wurden die 25 Stämme an das Industriemedium von Allmicroalgae angepasst, das auf Guillards F/2-Medium77 basierte und 10 mM Stickstoff und 12,5 mM Eisen enthielt. Die Kulturen wurden bei 25 °C, 18/6 h L/D-Zyklus, 10–30 µmol m−2 s−1 gehalten. Meeresstämme wurden unter demselben Medium gezüchtet, jedoch mit Magnesiumwasser und NaCl ergänzt, um einen Salzgehalt von 30 g L−1 zu erreichen.

Genomische DNA wurde mit dem Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, Waltham, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers für gramnegative Bakterien extrahiert. Die 16S-rRNA-Gensequenz (spezifische Primerpaare verfügbar in SM-Tabelle 3) wurde durch PCR-Amplifikation unter denselben Bedingungen erhalten78. Die Sequenzierung wurde bei GATC Biotech (Ebersberg, Deutschland) durchgeführt und die erhaltenen Nukleotidsequenzen wurden manuell auf Qualität überprüft und mit der Software Geneious Prime 2021.2.2 (Biomatters Ltd., Auckland, Neuseeland) zusammengestellt. Die Sequenzen wurden vor jeder phylogenetischen Analyse mit der DECIPHER-Software79 auf mögliche Chimärenbildung überprüft. Die erhaltenen Sequenzen wurden in die BLASTn-Datenbank (Basic Local Alignment and Search Tool for Nucleotides) eingefügt und die Ergebnisse analysiert. Die mit dieser Studie verbundenen Sequenzen wurden in der GenBank-Datenbank unter den Zugangsnummern OR046505 bis OR046517 hinterlegt.

In der Endanalyse wurden insgesamt 183 Sequenzen verwendet, darunter 2 Stämme von Gloeobacter violaceus als Außengruppe, 159 Sequenzen von Cyanobakterien, einschließlich Typ- und Referenzstämmen, die von GenBank (National Center for Biotechnology Information, NCBI, Bethesda, MD, USA) abgerufen wurden 22 Sequenzen von LEGE-CC-Stämmen23. Das Alignment mehrerer Sequenzen wurde mit MAFFT v7.45080,81 erstellt und die Sequenzen wurden manuell Korrektur gelesen und bearbeitet. Das beste Substitutionsmodell für ML-basierte Analysen wurde mit der Software jModelTest 282 unter Verwendung des Akaike-Informationskriteriums ausgewählt. Die Maximum-Likelihood-Analyse (ML) wurde unter Verwendung des Substitutionsmodells GTR + G + I mit 1000 Bootstrap-Resampling-Replikaten unter Verwendung der IQ-TREE 2-Software83 durchgeführt. Der endgültige phylogenetische Baum wurde auf iTOL (Interactive Tree of Life)84 und Inkscape 1.285 bearbeitet.

Vor der Kultivierung in PBR wurden die Stämme 7 Tage lang in einen Orbitalschüttler SHK-2013 (100 U/min) gegeben, ALGAETRON AG230 (PSI Instruments), beleuchtet mit kaltweißer LED bei 70 µmol m−2 s−1 und 22 °C unter 18: 6 L/D-Zyklus. Die PBR-Kultivierung wurde in ALGEM-Systemen (Algenuity, UK) mit 25 (v/v %) Inokulum durchgeführt, was einem Kultivierungsvolumen von 0,2 l entsprach. ALGEM verfügt über eine geografische Umgebungsmodellierung, mit der eine bestimmte Umgebung präzise simuliert werden kann. Der Standort der Allmicroalgae SA-Produktionsanlage (39,652936 N, − 8,988986 W) wurde als virtueller Experimentierort genutzt, während Licht und Temperatur für den Monat Mai den Frühling simulierten. Der pH-Wert wurde auf 8 eingestellt und bei Bedarf durch die Injektion eines 30 %igen CO2-Luft-Gemisches gesteuert. Das Rühren wurde konstant auf 100 U/min eingestellt und es wurde keine Belüftung bereitgestellt. Die Kultivierung wurde 15 Tage lang durchgeführt und alle 2 oder 3 Tage wurden Proben zur Kulturüberwachung entnommen.

Die Biomasseernte erfolgte durch Zentrifugation (Herareus Megafuge 16R, Deutschland) bei 15.000 g für 10 Minuten bei 4 °C und wurde zur weiteren Analyse gelagert. Der Überstand wurde dann einem zweiten Zentrifugationsschritt bei 18.000 g für 20 Minuten und 4 °C unterzogen, um hartnäckige Biomasse und verbleibende Zelltrümmer zu entfernen. Anschließend wurde der Überstand in kaltem Ethanol im Verhältnis 3:1 (v/v %) ausgefällt und über Nacht bei −20 °C aufbewahrt. Zur Gewinnung des Niederschlags wurden ein Sieb und ein Sieb verwendet, der dann getrocknet und gelagert wurde.

Die Biomasseproduktivität wurde aus der an den Tagen zwei und fünfzehn ermittelten Biomassekonzentration berechnet. Kurz gesagt wurde die Biomassekonzentration durch Trockenzellmessungen bestimmt, die unter milder Vakuumfiltration durchgeführt wurden. Ammoniumbicarbonat (0,5 M) wurde zum Waschen der GF/F-Glasmikrofaserfilter (Whatman) verwendet. Die Filter (F) wurden zuvor mindestens 24 Stunden lang bei 60 °C dehydriert, gefolgt von einer Stunde lang in Silica-Kammern, vor (F1) und nach (F2) der Biomasseretention. Das der Biomassekonzentration entsprechende Trockenzellgewicht wurde in g·L−1 ermittelt und gemäß Gl. berechnet. 1. Die Biomasseproduktivität wurde gemäß Gl. berechnet. 2.

Der Proteingehalt der fünfzehn Stämme, die in der simulierten Umgebung wuchsen, wurde durch CHN-Elementaranalyse gemäß dem vom Hersteller bereitgestellten Verfahren unter Verwendung eines Vario el III (Vario EL, Elemental Analyzer System, GmbH, Hanau, Deutschland) geschätzt. Der endgültige Proteingehalt wurde durch Multiplikation des Stickstoffanteils mit 5,2286 bestimmt.

Der Lipid-, Asche- und Kohlenhydratgehalt wurde nur für die produktivsten Stämme geschätzt. Der Lipidgehalt wurde mit der in beschriebenen Bligh & Dyer-Methode87 mit geringfügigen Modifikationen88 geschätzt. Kurz gesagt, gefriergetrocknete Cyanobakterienproben (7–35 mg) wurden mit ~ 0,6 g Glasperlen gemischt und mit Methanol durch Perlenmahlen unter Verwendung einer Retsch MM 400-Rührmühle bei 30 Hz für 3 Minuten extrahiert. Die Röhrchen wurden zentrifugiert (10.000 g) und die Überstände wurden in neuen Fläschchen gesammelt. Die Pellets wurden einer zweiten Extraktion unterzogen und beide Methanolüberstände wurden gepoolt. Dem Methanol wurden Chloroform und Wasser zugesetzt (2:1:2) und die Proben wurden 5 Minuten lang gevortext. Anschließend wurden die Proben zentrifugiert (2500 g für 10 min), um ein zweiphasiges System zu erhalten, und der Lipidextrakt (Chloroform) wurde abgetrennt. Ein bekanntes Volumen der Extrakte wurde in vorgewogene Röhrchen überführt, eingedampft und gewogen, um die Lipide gravimetrisch zu bestimmen. Der Aschegehalt wurde durch 6-stündiges Verbrennen der gefriergetrockneten Biomasse (ca. 35 mg) in einem Ofen (JP Selecta, Selhorn R9-L, Barcelona, Spanien) bei 550 °C bestimmt. Der Kohlenhydratgehalt wurde durch Differenzierung der übrigen Makronährstoffe bestimmt.

Rohe RPS-Proben wurden bei Bedarf mit Ultrafiltrationsmembranen (Ausschlussgrenze 50 kDa) und der AMICON Ultra-4 Zentrifugalfiltereinheit gereinigt. Kurz gesagt, rohe RPS-Proben wurden in hochreinem Wasser solubilisiert und 10 Minuten lang bei 5000 U/min und Raumtemperatur zentrifugiert. Leitfähigkeit und Salzgehalt wurden verfolgt (HANNA Instruments), um das Vorhandensein von Salzen zu verfolgen. Wenn eine 0,2 % (w/v) RPS-Lösung eine niedrige Leitfähigkeit (< 500 µS cm−2) aufwies, wurde sie für eine weitere Analyse als geeignet erachtet.

Zur Bestimmung der Monosaccharidzusammensetzung wurde Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) von Eletrocnic Impact (EI) verwendet. Kurz gesagt wurde 1 ml 2 M Trifluoressigsäure (TFA) zur Auflösung von 10 mg RPS verwendet. Der Hydrolyseschritt wurde mit einem Thermoblock bei 120 °C für 90 Minuten durchgeführt, gefolgt von einer Lösungsmittelverdampfung unter Stickstoffatmosphäre bei 60 °C. Die Trimethylsilylierungs-Derivatisierungsmethode wurde wie von Pierre und Mitarbeitern vorgeschlagen90,91 durchgeführt. L-Rhamnose (L-Rha), L-Fucose (L-Fuc), L-Arabinose (L-Ara), D-Xylose (D-Xyl), D-Mannose (L-Man), D-Galactose (D -Gal), D-Glucose (D-Glc), D-Glucuronsäure (D-GlcA), D-Galacturonsäure (D-GalA), D-Glucosamin (D-GlcN) und D-Galactosamin (D-GalN). ) wurden als Standards verwendet. Die Proben wurden auf einem Shimadzu Nexus Gas Chromatrography 2030-System injiziert, das an ein GCMS-QP2020NX (Shimadzu, Japan) gekoppelt war und mit einer OPTIMA-1MS Accent-Säule (Macherey-Nagel, 30 m, 0,25 mm, 0,25 µm) ausgestattet war. Die Wasserstoffdurchflussrate betrug eingestellt auf 1,75 ml min-1. (7,8 psi). Die erste Temperaturrampe wurde während 2,75 min auf 100 °C eingestellt, dann wurde ein Anstieg bis 200 °C bei 8,4 °C min-1 erreicht. Die zweite Temperaturrampe wurde erhöht bis 215 °C während 0,95 min bei konstanter Geschwindigkeit. Die elektronische Ionisation (EI, 70 eV) wurde bei 150 °C durchgeführt und das Zielion wurde auf 40–800 m/z fixiert. Die Lösungsmittelschnittzeit wurde auf 5 min eingestellt , das Teilungsverhältnis betrug 50:1 und die Temperatur des Injektors betrug 250 °C. Die relativen Molverhältnisse wurden gemäß der Flächennormalisierung bestimmt. MestReNova Software 7.1.0–9185 (Mes-trelab Research, Coruña, Spanien) war zur Analyse der Daten verwendet.

Hochdruck-Größenausschlusschromatographie (HPSEC), gekoppelt mit drei Detektoren: Mehrwinkel-Laserlichtstreuungsdetektor (MALS, Mini-DAWN TREOS II, Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA, USA), Differential-Brechungsindex-Detektor (DRI) ( RID-10 A, Shimadzu, Duisburg, Deutschland) und ein UV-Vis-Detektor (SPD-20A, Shimadzu, Duisburg, Deutschland) wurden zur Bestimmung des Molekulargewichts der Proben verwendet. Die HPSEC-Linie bestand aus einer SB-G-Vorsäule und drei in Reihe geschalteten Säulen (SB-806 HQ, SB-804 HQ und SB-803 HQ). Das System wurde mit NaNO3 0,1 M und NaN3 2,5 mM eluiert, durch einen 0,02 µm, 47 mm Membranfilter (Anotop 47, Whatman, Maidstone, England) filtriert und sorgfältig entgast. RPS-Proben wurden zuvor durch mindestens 24-stündiges Rühren im Elutionspuffer bei 60 °C hergestellt und 20 s lang in Ultraturrax bei 19.000 U/min homogenisiert. Zuletzt wurden die Proben durch einen 0,45 μm Spritzenfilter (Grace Altech, Maryland, USA) filtriert. Die Injektion erfolgte über eine 100-µL-Vollschleife und die Elution erfolgte mit einer Flussrate von 0,5 ml/min. Die Datenauswertung erfolgte mit der Software ASTRA 7.2.2.

Der Cyanotoxin-Nachweis erfolgte mittels molekularer Methoden. Genomische DNA wurde wie im Abschnitt „DNA-Extraktion, Amplifikation (PCR) und Sequenzierung“ erhalten. Die Gene mcyE, mcyA wurden für das Produktionspotenzial von Microcystin (MCs) und Nodularin (NOD), sxtA, sxtG und sxtI für Saxitoxin (STX) und cyrJ Cylindrospermosin (CYN) und anaC-gen für Anatoxin (ANA) unter Verwendung spezifischer Primerpaare gezielt verfügbar in SM-Tabelle 3.

Sowohl Zellen als auch Medien wurden mittels ESI-LC-MS/MS analysiert, um die Synechocystis sp. chemisch zu bestätigen. LEGE 07.367 Toxizität des Saxitoxin-positiven molekularen Ergebnisses. Zellen (frische Pellets) wurden nach der Zentrifugation gesammelt, vom Medium getrennt (lyophilisiert) und mit einigen Modifikationen extrahiert92. Die Zellen wurden in 15 ml einer methanolischen Lösung (MeOH:H2O, Vol./Vol. 20:80) gelöst, zur Lyse beschallt (Eis, 95 % Amplitude, 5 Min.) und zentrifugiert (5000 g, 4 °C, 2 Min.). . Diese Extraktion wurde zweimal wiederholt und alle Überstände wurden vor der vollständigen Trocknung des Methanols im Rotationsverdampfer zusammengegeben.

Sowohl Zellextrakte als auch lyophilisierte Medien wurden in 200 ml hochreinem Wasser (LC-MS-Qualität) resuspendiert, bevor sie einer Festphasenextraktion mit Supelclean ENVI-Carb-Kartuschen (250 mg, 6 ml, SUPELCO, Sigma-Aldrich, USA) unterzogen wurden.

Die ENVI-carb-Kartusche wurde mit 6 ml Dichlormethan (DCM), 6 ml MeOH und 6 ml hochreinem Wasser (LC-MS-Qualität) benetzt. Proben (200 ml) wurden mit ~ 10 ml min−1 über einen Vakuumverteiler mit 12 Anschlüssen (Waters, USA) geladen. Anschließend wurden die Kartuschen unter Stickstoff trockengeblasen, mit 10 ml 60:40 MeOH:DCM (0,5 % Ameisensäure) in 15 ml-Glasreagenzgläsern eluiert und unter Vakuum mit einem Rotationsverdampfer getrocknet. Der endgültige Extrakt wurde dann mit 500 µL 10:90 H2O:MeOH (0,1 % Ameisensäure) rekonstituiert und zur LC-MS/MS-Analyse in ein 1,5-ml-Fläschchen überführt.

Die Proben wurden in ein Flüssigchromatograph-Thermo-Finnigan-Surveyor-HPLC-System (Thermo Scientific, MA, USA) injiziert, gekoppelt mit einem Massenspektrometrie-LCQ-Fleet™-Ionenfallen-Massenspektrometer (Thermo Scientific, MA, USA). Das für die Datenerfassung und -verarbeitung verwendete Programm ist XcaliburTM Version 2. Die Optimierung der Parameter der Mass Spectrometer Tune Method wurde durch direkte Injektion einer Saxitoxin-Standardlösung (CRM-00-STX, Charge 18-001, 99 % Reinheit, von Cifga, ES) durchgeführt von 1 ppm in 10:90 H2O:MeOH (0,1 % Ameisensäure).

Massenspektrometer betrieben im Elektrospray-Modus mit positiver Polarität unter Verwendung von Full Scan (30–1500 m/z) und kollisionsinduzierter Dissoziation (CID) bei 300 m/z und 316 m/z, entsprechend den Ionenvorläufern der Saxitoxin- und Neosaxitoxin-Moleküle.

Die Sprühspannung wurde bei 7,0 kV gehalten; Kapillartemperatur bei 350 °C; Kapillarspannung und Tubuslinse werden bei 22 bzw. 50 kV gehalten. Stickstoff wurde als Hüll- und Hilfsgas sowie Kollisionsenergie bei 35 eV verwendet.

Die Trennung wurde auf einem ACE Excel C18 (50 × 2,1 mm ID, 1,7 μm, Charge: v19-3430, AVANTOR ACE ®, VWR, PT) bei 30 °C und einer Durchflussrate von 0,25 ml/min erreicht. und das injizierte Volumen betrug 10 μl im Schleifenteilmodus. Die verwendeten Eluenten waren Methanol (A) und Wasser (B), beide angesäuert mit Ameisensäure zu 0,1 % (v/v). Das Gradientenprogramm begann bei 30 % A, stieg in 10 Minuten auf 60 % A an, kehrte in 5 Minuten zu den Ausgangsbedingungen zurück und stellte weitere 10 Minuten mit 30 % A ins Gleichgewicht.

Unter diesen Bedingungen betrug die SAX-Retentionszeit (RT) 3,75 Minuten und die Nachweisgrenze (LOD) und die Quantifizierungsgrenze (LOQ) lagen bei 3 μg L−1 bzw. 5 μg L−1. Das Vorläuferion (m/z 300) und SAX-Referenzfragmentionen mit m/z-Werten von 282, 266, 240, 221, 204 und 144 wurden im CID-Modus durchsucht, um das Vorhandensein oder Fehlen des Toxins zu validieren.

Alle Analysen wurden mit R-Software93 durchgeführt. Der nichtparametrische Kruskal-Wallis-Test wurde mit der Funktion kruskal.test aus dem Paket stats und der Post-hoc-Nemenyi-Test mit der Funktion kwAllPairsNemenyiTest aus dem Paket PCMMRplus durchgeführt. Die multivariate Varianzanalyse (MANOVA) wurde mit der Manova-Funktion aus dem Statistikpaket und der multivariate Shapiro-Wilks-Test mit der Funktion mvShapiro.Test aus dem Paket mvShapirotTest durchgeführt. Der Spearman-Korrelationskoeffizient wurde mit der Cor-Funktion aus dem Statistikpaket berechnet. Die nichtmetrische mehrdimensionale Skalierung unter Verwendung der Bray-Curtis-Distanz wurde mit der metaMDS-Funktion aus dem Vegan-Paket durchgeführt. PCA wurde mit der PCA-Funktion aus dem FactoMineR-Paket durchgeführt.

Die Zugangsnummern der genetischen Sequenzen wurden in GENBANK hinterlegt und sind in ergänzendem Material verfügbar – Tabelle S2. Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Forschung wurde von FCT UIDB/04423/2020 und UIDP/04423/2020 sowie vom Atlantic Interreg Project Enhance MicroAlgae – High Added-Value Industrial Opportunities for Microalgae in the Atlantic Area [EAPA_338/2016] finanziert.

Fakultät für Naturwissenschaften, Universität Porto, Rua do Campo Alegre, 4169-007, Porto, Portugal

José Diogo Cruz, João Morais & Vitor Vasconcelos

Interdisziplinäres Zentrum für Meeres- und Umweltforschung (CIIMAR/CIMAR), Universität Porto, Kreuzfahrtterminal Porto de Leixões, Avenida General Norton de Matos, S/N, 4450-208, Matosinhos, Portugal

José Diogo Cruz, Aldo Barreiro Felpeto, João Morais, Joana Azevedo und Vitor Vasconcelos

Universität Clermont Auvergne, Clermont Auvergne INP, CNRS, Institut Pascal, 63000, Clermont-Ferrand, Frankreich

Cédric Delattre, Guillaume Pierre, Pascal Dubessay und Philippe Michaud

Institut Universitaire de France (IUF), 75005, Paris, Frankreich

Cedric Delattre

GreenCoLab – Oceano Verde Association, Universität Algarve, Campus de Gambelas, 8005-139, Faro, Portugal

Hugo Pereira

UMRT INRAE 1158 BioEcoAgro, Pflanzenbiologie und Innovation (BIOPI), Universität Picardie Jules Verne, IUT von Amiens, Avenue des Facultés, Le Bailly, 80025, Amiens, Frankreich

Emmanuel Petit & Redouan Elboutachfaiti

Forschungs- und Entwicklungsabteilung, Allmicroalgae Natural Products SA, 25. April 19, 2445-287, Pataias, Portugal

Joana Silva

CCMAR – Zentrum für Meereswissenschaften, Universität Algarve, 8005-139, Gambelas, Faro, Portugal

Inês B. Maia

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Das JDC konzipierte, gestaltete und führte die Experimente durch; bereitete die Abbildungen/Tabellen vor und verfasste das Manuskript. HP, GP, JM, EP, JA, RE, IM führten Experimente durch, erstellten die Abbildungen/Tabellen und trugen zum Manuskript bei. ABF erstellte die Abbildungen/Tabellen und führte die statistische Analyse durch. CD, JS, PD, PM, VV haben die Experimente konzipiert und gestaltet, das Papier verfasst und zur Finanzierung beigetragen.

Korrespondenz mit Vitor Vasconcelos.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 16. März 2023

Angenommen: 12. August 2023

Veröffentlicht: 21. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40542-6

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